1 概述
1.1 藥物代謝研究簡介
藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗,，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系,。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用,，研究藥物代謝對于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關(guān)重要,。
藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣,，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性,，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低，代謝產(chǎn)物的檢測具有一定的困難,。體外代謝法在短時間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物,，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈",，代謝物易于分離,、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結(jié)果的確定等,，因而,，體外代謝法具有突出的*性。
由于肝臟是藥物代謝的主要場所,，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ),。目前,，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法,、肝細胞體外溫孵法,、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中,，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比,，酶制備簡單，代謝過程快,，重現(xiàn)性好,，易大量操作，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究,，因而在實際工作中應用較為普遍,。
1.2 藥物代謝
藥物代謝，又稱藥物的生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）,，是指藥物經(jīng)過體內(nèi)吸收、分布之后,，在藥酶的作用下經(jīng)歷化學結(jié)構(gòu)變化的過程,，是藥物從體內(nèi)消除的主要方式之一。藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化,，分為Ⅰ相代謝反應和Ⅱ相代謝反應,。
肝臟是藥物代謝的重要器官，是機體進行生物轉(zhuǎn)化的主要場所,，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶,。在肝臟中，參與藥物代謝的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶中以P450酶最為重要,，它是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質(zhì),。P450酶存在明顯的種屬、性別和年齡的差異,，其中以種屬差異表現(xiàn)最為明顯,，不同種屬的P450同工酶的組成不同，因此藥物在不同種屬的動物和人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能是不同的,。
1.3 藥物的Ⅰ相代謝
藥物在Ⅰ相代謝反應中主要發(fā)生氧化,、還原和水解的反應，經(jīng)過Ⅰ相代謝反應,，藥物可能帶有一些極性基團,，如羥基、羧基等,。
氧化反應是最多見的第Ⅰ相反應,，單加氧酶系是氧化異源物最重要的酶,，單加氧酶主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中，能催化烷烴,、烯烴,、芳烴和類固醇等多種物質(zhì)進行氧化。由細胞色素P450,、NADPH+H+,、NADPH-細胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃酶），催化基本反應為：
RH+O2+NADPH+H+→ROH+NADP++H2O
單加氧酶能直接激活氧分子,，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環(huán)氧化物,，另一個氧原子則被NADPH還原為水。由于一個氧分子發(fā)揮了兩種功能,，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶,；又因底物的氧化產(chǎn)物是羥化物，所以又稱為羥化酶,。加單氧酶的（見圖1）
圖1 加單氧酶的反應
肝細胞微粒體內(nèi)存在的還原酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶,，是第Ⅰ相反應的主要還原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類（見圖2）,。
圖2 硝基苯和偶氮苯的還原反應
肝微粒體中含有多種水解酶,，如酯酶、酰胺酶,、糖苷酶等,，可分別催化酯類、酰胺類,、糖苷類化合物的水解（見圖3）,，以降低或消除其生物活性。
圖3 乙酰水楊酸的水解反應
2 Ⅰ相代謝穩(wěn)定性實驗原理
肝藥酶CYP即細胞色素P450氧化酶（CYP450）,，屬于單加氧酶（momooxygenase）,，也稱肝微粒體混合功能氧化酶，多位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)壁上,，參與藥物,、致癌物、類固醇激素和脂肪酸等多種內(nèi),、外源性物質(zhì)代謝,。肝藥酶CYP氧化還原酶（POR）是所有肝微粒體酶的電子供體，通過還原型咽酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,，NADPH）將電子傳遞給CYP450酶,，CYP450酶得到電子后再與底物發(fā)生氧化還原反應，從而發(fā)揮代謝活性,。
肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相酶,，其中最重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng),，在用肝微粒體進行研究時，如加入相應的輔助因子NADPH,，則可重組體外代謝體系,，從而通過體外溫孵法進行Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究。
3 肝微粒體體外溫孵法實驗方法描述
肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體,，輔以NADPH再生系統(tǒng),，在體外模擬生理環(huán)境條件進行代謝反應，經(jīng)過一定時間的反應后,，采用HPLC,、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物，并對代謝產(chǎn)物進行初步的分析和鑒定的方法,。
3.1 肝微粒體制備
微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu),，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分,，在體外實驗中具有蛋白質(zhì)合成,、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。目前,，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法,。具體制備流程見下圖（見圖4）
圖4 肝微粒體制備流程圖
3.2 體外孵育體系的建立
Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶,，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應的體系。
以每個孵育體系總體積為200 µL為例,，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液,，NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖,，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶,，3.3 mM的氯化鎂）；0.1mg/mL~1mg/mL的肝微粒體蛋白,；合適濃度的待測物,，一般推薦為1μM，于37°C水浴孵育,，每個樣品平行3次,，以不包含NADPH發(fā)生系統(tǒng)的樣品作為陰性對照。于預設(shè)的反應時間點,，如0,，5，10,，15,，30,，60 min后加入等體積預冷的乙腈終止反應。
3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測
采用HPLC,、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物,。圖5為采用LC-MS/MS測定藥物在人、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況,，從圖上可知,，藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝，但不同種屬間又存在顯著差異,。（見圖5）
圖5藥物在人,，犬，大鼠肝微粒體中的代謝情況
4 Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試劑盒簡介
北京匯智泰康生物技術(shù)有限公司針對藥物代謝研究的需要,，以肝微粒體體外溫孵法為指導,，開發(fā)了一款專門用于Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究,，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程,，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測,，符合Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究試驗要求,，實驗結(jié)果準確、可靠,、重現(xiàn)性好,。
4.1 產(chǎn)品說明
本產(chǎn)品提供了藥物Ⅰ相代謝研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統(tǒng)及其它組分,，可直接用于藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性的研究,。本產(chǎn)品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體,、比格犬肝微粒體,、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據(jù)實際需求,，選擇不同種屬的肝微粒體,。
4.2 試劑盒優(yōu)勢
便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用,，大大縮短了實驗周期,。
準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗結(jié)果準確,、可靠,、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存,。
4.3 產(chǎn)品組成
注：陽性底物為睪丸酮和非那西汀混合物,，濃度為10mm。
4.4參考使用方法
4.4.1 試驗組
1）冰浴融化試劑盒各組分,，置于冰上待用,；
例：200μL孵育體系配制：
注：
a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%；
b.若實際需要n個孵育體系,，則需配置n＋1個體系,；
c.參考使用方法僅為使用范例，需根據(jù)實際試驗需求進行調(diào)整,。
2）向含有40 μL預孵育液A的離心管中加入160 μL預孵育液B,，吹打3次混勻，立即置于37℃水浴中進行孵育并計時,；
3) 于設(shè)定孵育時間點,，向孵育體系中加入終止液終止反應（如預冷乙腈，預冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）,。
4.4.2 對照組
1）陽性對照組：將受試物換為陽性底物,；
2）陰性對照組：不加A液、B液,；
3）空白對照組：只包含底物和PBS緩沖液,。
4.5 使用注意事項
1）試驗開始前，請自行準備2.0mL離心管,、不同規(guī)格槍頭,、37℃水浴鍋等；
2）本產(chǎn)品僅供科研使用,，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷,；
3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻,；
4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融,；
5）在使用過程中,，也可根據(jù)實際實驗需求調(diào)整試劑盒使用方法和各組分的加入量。
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