外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）制備方法及注意事項(xiàng)
外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）,，是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞,，包括淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）、單核細(xì)胞（Monocyte）,、樹突狀細(xì)胞（DC）和其他少量細(xì)胞,。PBMC可利用健康人或動(dòng)物供體的外周血，通過Ficoll密度梯度離心,，磁珠分選等步驟獲得,，主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
Ficoll是蔗糖的多聚體,，中性,，平均分子量400,000，當(dāng)密度為1.2g/mL,，未超出正常生理性滲透壓,，也不穿過生物膜。紅細(xì)胞,、粒細(xì)胞比重大,，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重,，離心后漂浮于分層液的液面上,，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞,，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞,。
人PBMC中不同細(xì)胞類型的比例
PBMC中大部分都是淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞,，其中CD3+T細(xì)胞又占了淋巴細(xì)胞中絕大部分(45-70%),。這些T細(xì)胞都處于初始（naive）狀態(tài)，即已經(jīng)成熟了但沒有受到抗原刺激,。 在正常人中,，只有非常小的一部分初始T細(xì)胞會(huì)因抗原識(shí)別而被激活。同樣的B細(xì)胞也都處于初始狀態(tài),。相對(duì)于淋巴細(xì)胞,，單核細(xì)胞的比例在10-30%,，收到刺激之后會(huì)發(fā)育成樹突狀細(xì)胞(DC)或巨噬細(xì)胞。干細(xì)胞的比例非常低,，只有0.1-0.2%,，因此很難從全血樣本中分離到。
一,、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）制備方法
1.設(shè)備與試劑
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培養(yǎng)基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亞砜（DMSO）（SIGMA）
預(yù)先裝好異丙醇的凍存盒
2.方法/步驟
配制所需的溶液：
a. 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S,；
b. 細(xì)胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；
（1）在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）與無菌PBS按照1:1充分混勻,，用移液管沿管壁緩慢疊加于分層液面上,，動(dòng)作一定要輕，注意保持清楚的界面,。外周血,，PBS，淋巴細(xì)胞分離液終體積比為1:1:1,。
（3）水平離心400g×30分鐘（可根據(jù)淋巴細(xì)胞分離液Ficoll或離心機(jī)轉(zhuǎn)子要求調(diào)整）
（4）離心后可看見管內(nèi)分為三層,，上層為血漿和PBS，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞,，中層為淋巴細(xì)胞分離液,。在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶,，主要就是單個(gè)核細(xì)胞,，包括淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞。此外,，還含有血小板,。
（5）去除部分上層液體，余下約1mL,，用移液器插到云霧層,，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一離心管中,，加入5倍以上體積的PBS,，離心300g×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次,。
（6）末次離心后,，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液,，室溫孵育2分鐘,，裂解紅細(xì)胞，可根據(jù)情況適當(dāng)增減時(shí)間。
（7）加入10mLPBS,，離心300g×10分鐘,，洗滌細(xì)胞兩次。
（8）末次離心后,，棄上清,，加入含有10%FBS的RPMI1640，重懸細(xì)胞,，計(jì)數(shù),，計(jì)算細(xì)胞活力,。
注意事項(xiàng)
全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層,，但是終都必須保證兩種溶液分層清晰。
分離PBMC離心的時(shí)候,，一定不能設(shè)置低水平的制動(dòng),。否則將分層混亂。
細(xì)胞運(yùn)輸與保存
（1）干冰運(yùn)輸,，收到細(xì)胞后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇,；
（2）T25瓶運(yùn)輸細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng),，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),，再進(jìn)行凍存，具體操作步驟見細(xì)胞培養(yǎng)步驟,。
PBMC收到后注意事項(xiàng)：
（1）收到PBMC細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)反饋,。
（2）先不打開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放培養(yǎng)箱靜置四小時(shí),，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),，切忌在溫箱內(nèi)靜置過夜。
（3）靜置后鏡檢,，拍照,，記錄細(xì)胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況,。
（4）貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞密度超過80%,，可正常傳代；若未超過80%,，收集細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,，留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。
（5）細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗,，可收集后4℃保存?zhèn)溆?，可補(bǔ)加2%血清。剛開始傳代時(shí)建議一半用細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,，一半用自備的培養(yǎng)基,，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件，以免因不適應(yīng)而造成生長(zhǎng)狀態(tài)不佳,。
（6）細(xì)胞胰酶消化液建議使用PBS配制,。
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不同種屬PBMC：人,，猴,，犬，大鼠,，小鼠
貨號(hào) 產(chǎn)品 狀態(tài)
0621011/0621012 人外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC Fresh/Frozen
0621021/0621022 猴外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC Fresh/Frozen
0621031/0621032 比格犬外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC Fresh/Frozen
0621041/0621042 大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC Fresh/Frozen
0621051/0621052 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC Fresh/Frozen
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