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Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究原理及實驗方法

1 概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容,，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質量有密切關系,。因而,，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關重要,。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種,。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣，加上代謝轉化的器官和酶系的多樣性,，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低,，代謝產(chǎn)物的檢測具有一定的困難。體外代謝法在短時間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物,，且代謝條件可控,，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取,，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結果的確定等,，因而，體外代謝法具有突出的*性,。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所,，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前,，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法,、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法,、肝臟離體灌流法和肝切片法,。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比,，酶制備簡單,，代謝過程快，重現(xiàn)性好,，易大量操作,，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍,。

1.2 藥物代謝

藥物代謝,，又稱藥物的生物轉化（biotransformation），是指藥物經(jīng)過體內(nèi)吸收,、分布之后,，在藥酶的作用下經(jīng)歷化學結構變化的過程，是藥物從體內(nèi)消除的主要方式之一,。藥物在體內(nèi)的生物轉化,，分為Ⅰ相代謝反應和Ⅱ相代謝反應。

肝臟是藥物代謝的重要器官,，是機體進行生物轉化的主要場所，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶,。在肝臟中,，參與藥物代謝的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶中以P450酶重要，它是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質,。P450酶存在明顯的種屬,、性別和年齡的差異，其中以種屬差異表現(xiàn)明顯,，不同種屬的P450同工酶的組成不同,，因此藥物在不同種屬的動物和人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能是不同的,。

1.3 藥物的Ⅰ相代謝

藥物在Ⅰ相代謝反應中主要發(fā)生氧化、還原和水解的反應,，經(jīng)過Ⅰ相代謝反應,，藥物可能帶有一些極性基團，如羥基,、羧基等,。

氧化反應是多見的第Ⅰ相反應，單加氧酶系是氧化異源物重要的酶,，單加氧酶主要存在于滑面內(nèi)質網(wǎng)的微粒體中，能催化烷烴,、烯烴,、芳烴和類固醇等多種物質進行氧化。由細胞色素P450,、NADPH+H⁺,、NADPH-細胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃酶），催化基本反應為：

RH+O₂+NADPH+H⁺→ROH+NADP⁺+H₂O

單加氧酶能直接激活氧分子,，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環(huán)氧化物,，另一個氧原子則被NADPH還原為水。由于一個氧分子發(fā)揮了兩種功能,，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶,；又因底物的氧化產(chǎn)物是羥化物，所以又稱為羥化酶,。加單氧酶的反應見圖1：

圖1 加單氧酶的反應

肝細胞微粒體內(nèi)存在的還原酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶,，是第Ⅰ相反應的主要還原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類（見圖2）,。

圖2 硝基苯和偶氮苯的還原反應

肝微粒體中含有多種水解酶,，如酯酶、酰胺酶,、糖苷酶等,，可分別催化酯類、酰胺類,、糖苷類化合物的水解（見圖3）,，以降低或消除其生物活性。  

                                                                       圖3 乙酰水楊酸的水解反應

2 Ⅰ相代謝穩(wěn)定性實驗原理

肝藥酶CYP即細胞色素P450氧化酶（CYP450）,，屬于單加氧酶（momooxygenase）,，也稱肝微粒體混合功能氧化酶，多位于內(nèi)質網(wǎng)和線粒體內(nèi)壁上,，參與藥物,、致癌物、類固醇激素和脂肪酸等多種內(nèi)、外源性物質代謝,。肝藥酶CYP氧化還原酶（POR）是所有肝微粒體酶的電子供體,，通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）將電子傳遞給CYP450酶,，CYP450酶得到電子后再與底物發(fā)生氧化還原反應,，從而發(fā)揮代謝活性。

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相酶,，其中重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng),，在用肝微粒體進行研究時，如加入相應的輔助因子NADPH,，則可重組體外代謝體系,，從而通過體外溫孵法進行Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究。

3 肝微粒體體外溫孵法實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體,，輔以NADPH再生系統(tǒng),，在體外模擬生理環(huán)境條件進行代謝反應，經(jīng)過一定時間的反應后,，采用HPLC,、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物，并對代謝產(chǎn)物進行初步的分析和鑒定的方法,。

3.1 肝微粒體制備

微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構,，是異質性的集合體。它包含內(nèi)質網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分,，在體外實驗中具有蛋白質合成,、蛋白質糖基化和脂類合成等內(nèi)質網(wǎng)的基本功能。目前,，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法,。具體制備流程見下圖（圖4）：

圖4 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶,，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應的體系,。

推薦使用的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液,，NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP,，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶,，3.3 mM的氯化鎂）,；0.5 mg/mL的肝微粒體蛋白；合適濃度的待測物,，于37°C水浴孵育,，每個樣品平行3次,，以不包含NADPH發(fā)生系統(tǒng)的樣品作為陰性對照。于預設的反應時間點,，如0,，5，10,，15,，30，60 min后加入等體積預冷的乙腈終止反應,。

3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測

采用HPLC,、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物。圖5為采用LC-MS/MS測定藥物在人,、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況,，從圖上可知，藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝,，但不同種屬間又存在顯著差異。

                                                         圖5藥物在人,，犬,，大鼠肝微粒體中的代謝情況

4 匯智和源/匯智泰康Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試劑盒簡介

北京匯智和源生物技術有限公司針對藥物代謝研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導,，開發(fā)了一款專門用于Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的試劑盒,，該產(chǎn)品可直接用于藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程,，大大縮短了實驗周期,，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質量檢測，符合Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究試驗要求,，實驗結果準確,、可靠、重現(xiàn)性好,。

4.1 產(chǎn)品說明

本產(chǎn)品提供了藥物Ⅰ相代謝研究用到的肝微粒體,、NADPH再生系統(tǒng)及其它組分，可直接用于藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性的研究,。本產(chǎn)品可提供肝微粒體有：人肝微粒體,、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體,、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體,，可根據(jù)實際需求，選擇不同種屬的肝微粒體,。

4.2 試劑盒優(yōu)勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間,，可以直接使用,，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質量檢測,，實驗結果準確,、可靠、重現(xiàn)性高,。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強,、易于運輸和保存。

4.3 產(chǎn)品組成

50反應/盒,，200μL/反應,。

4.4 產(chǎn)品使用說明

本產(chǎn)品需于-70℃冰箱冷凍保存，切記避免反復凍融,。試驗具體操作如下：

4.4.1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分,，置于冰上待用；

2）除微粒體外,，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻,，于37℃預孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%,。

   b.若實際需要n個孵育體系,，則需配置n＋1個體系。

3）將以上混合液195μL/管分裝至1.5mL離心管中,，于37℃水浴中保溫,， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應,，使用秒表計時,；

4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入200μL預冷的乙腈終止反應（預冷乙腈：孵育體系體積=1:1）,。

4.4.2 對照組

1）陽性對照組：將受試物換為陽性底物,；

2）陰性對照組：不加A液、B液,；

3）空白對照組：只包含底物和PBS緩沖液,。

4.5 運輸條件

干冰運輸。

4.6 使用注意事項

1）驗開始前,，請自行準備1.5mL離心管,、不同規(guī)格槍頭、乙腈,、37℃水浴鍋等,。

2）產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷,。

3）用前,，需于冰浴條件下解凍并混合均勻,。

4）-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融,。

5)用過程中,，也可根據(jù)實際實驗需求調整各組分的加入量。