鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn),，Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay）于 1975年建立并不斷發(fā)展完善，目前已被世界各國(guó)廣為采用,，已經(jīng)成為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室必需開展的重要實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,。Ames實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)待分析物質(zhì)的致突變作用，該驗(yàn)靈敏,、高效,、檢測(cè)范圍廣。
Ames 試驗(yàn)原理
Ames 試驗(yàn)利用鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,，該缺陷型菌株不能合成組氨酸,，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng),；假如有致突變物存在,，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌誘導(dǎo)回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落,，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物,。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的 S9混合液,。北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)Ames試驗(yàn)開發(fā)Ames試劑盒,， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備,、菌株 鑒定,、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用,，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期,；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，無雜菌污染,，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,、重現(xiàn)性高,。Ames試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品與飲用水,、化學(xué)品,、洗滌劑,、消毒劑、食品添加劑,、藥物殘留,、化妝品,、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。
Ames試驗(yàn)導(dǎo)則
1 范圍
本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則,、要求和方法。
本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè),。
2 規(guī)范性引用文件
OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定義
3.1 回復(fù)突變（Reverse mutation）
細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph),。
3.2 基因突變 （Gene mutation）
在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化,。
3.3 堿基置換突變 （Base substitution mutation）
引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。
堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式,。
轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代,，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。
顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代,，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替,。
3.4 移碼突變（ Frameshift mutation）
引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。
3.5 鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）
利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗(yàn)方法,。
3.6 S9
經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯.八比鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿,，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。
4 原理
鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸,，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng),。假如有致突變物存在,，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落,，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物,。可使用北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的Ames試劑盒，試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備,、誘導(dǎo) S9 制備,、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間,，可以直接使用,，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期,。
某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變,， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液,。
5 儀器和設(shè)備
培養(yǎng)箱、恒溫水浴,、振蕩水浴搖床,、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱,、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器,、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g),、混勻振蕩器,、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器,、低溫高速離心機(jī),，玻璃器皿等。
6 培養(yǎng)基和試劑
6.1 0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液
成分： L-組氨酸(MW 155) 78mg
D-生物素(MW 244) 122mg
加蒸餾水至 1000mL
配制：將上述成分加熱,，以溶解生物素,，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱,。
6.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基
成分： 瓊脂粉 1.2g
氯化鈉 1.0g
加蒸餾水至 200mL
配制：上述成分混合后,，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實(shí)驗(yàn)時(shí),，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL,。
6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基E
成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 500g
磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 175g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 10g
加蒸餾水至 1000mL
配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中,，加蒸餾水至1000mL,。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱,。
6.4 20%葡萄糖溶液
成分：葡萄糖 200g
加蒸餾水至 1000mL
配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖,，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min,。儲(chǔ)于4℃冰箱,。
6.5 底層瓊脂培養(yǎng)基
成分：瓊脂粉 7.5g
蒸餾水 480mL
V-B培養(yǎng)基E 10mL
20%葡萄糖溶液 10mL
配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分,，充分混勻倒底層平板,。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h,，備用,。
6.6 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
成分：牛肉糕 2.5g
胰 胨 5.0g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g
加蒸餾水至 500mL
配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱,。
6.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)
成分：LV化鉀(KCl) 61.5g
氯化鎂(MgCl2·6H2O) 40.7g
加蒸餾水至 500mL
配制：在水中溶解上述成分后,，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱,。
6.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)
成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.965g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 29.015g
加蒸餾水至 500mL
配制：溶解上述成分后,，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱,。
6.9 S9混合液
成分 每毫升S9混合液
肝S9 100ml
鹽溶液 20ml
滅菌蒸餾水 380ml
0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500ml
輔酶II(NADP) 4mmol
6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol
配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱重,，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝S9加到已有緩沖液的溶液中,。該混合液必須臨用現(xiàn)配,，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄,。
6.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑
6.10.1 組氨酸—生物素平板
成分：瓊脂粉 15g
蒸餾水 944mL
(V-B)培養(yǎng)基E 20mL
20%葡萄糖 20mL
滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL
滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖,，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進(jìn)熱的瓊脂溶液中,。待溶液稍為冷卻后,，加入滅菌生物素,，混勻,，澆制平板。
6.10.2 氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板
成分：瓊脂粉 15g
蒸餾水 940mL
(V-B)鹽溶液 20mL
20%葡萄糖 20mL
滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL
滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL
四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL
配制：瓊脂和水高壓滅菌20min,，將無菌的葡萄糖,、VB鹽溶液和組氨酸—生物素溶液加進(jìn)熱的溶液中去，混勻,。冷卻至大約50℃,，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。
應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi),，制備主平板,。
6.10.3 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板
成份：瓊脂粉 7.5g
營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL
配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。
7 試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定
7.1 試驗(yàn)菌株
采用TA97,、TA98、TA100和TA102一組標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株,。
7.2 生物學(xué)特性鑒定
新獲得的或長(zhǎng)期保存的菌種,，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn),，如表1所示,。
表1 試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)
菌株 | 組氨酸 缺陷 | 脂多糖屏障缺損 | 氨芐青霉素抗性 | 切除修復(fù)缺損 | 四環(huán)素 抗性 | 自發(fā)回變菌落數(shù)* |
TA97 TA98 TA100 TA102 | + + + + | + + + + | + + + + | + + + - | - - - + | 90-180 30-50 100-200 240-320 |
注 | “+”表示需要組氨酸 | “+”表示具有rfa突變 | “+”表示具有R因子 | “+”表示具有△uvrB突變 | “+”表示具有pAQ1質(zhì)粒 | *在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增 |
7.2.1 組氨酸缺陷
原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上,，則不能生長(zhǎng),。
鑒定方法：將測(cè)試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果,。
結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長(zhǎng),，而在無組氨酸平板上則不能生長(zhǎng)。
7.2.2 脂多糖屏障缺損
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株,，其表面一層脂多糖屏障缺損,，因此一些大分子物質(zhì)如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長(zhǎng),，而野生型菌株則不受其影響,。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置,。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果,。
結(jié)果判斷：假若待測(cè)菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測(cè)菌株具有rfa突變,。
7.2.3 氨芐青霉素抗性
原理：含R因子的試驗(yàn)菌株對(duì)氨芐青霉素有抗性,。因?yàn)镽因子不太穩(wěn)定，容易丟失,，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否,。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線,，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果,。
結(jié)果判斷；假若測(cè)試菌在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng),，說明該測(cè)試菌具有抗氨芐青霉素作用,，表示含R因子，否則,，表示測(cè)試菌不含R因子或R因子丟失,。
7.2.4 紫外線敏感性
原理：具有△uvrB突變的菌株對(duì)紫外線敏感，當(dāng)受到紫外線照射后,，不能生長(zhǎng),，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長(zhǎng),。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線,，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W,，距離33cm）8秒鐘,。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果,。
結(jié)果判斷：具有△uvrB突變的菌株對(duì)紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長(zhǎng),，而具有完整的切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株,，則照常生長(zhǎng)。
7.2.5 四環(huán)素抗性
原理：具有pAQI的菌株對(duì)四環(huán)素有抗性,。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線,，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若測(cè)試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長(zhǎng),，表明該測(cè)試菌株對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性,，具有pAQI質(zhì)粒，否則,，說明測(cè)試菌株不含pAQI質(zhì)粒,。
7.2.6 自發(fā)回變
原理：每種試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變,。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性,。
鑒定方法：將待測(cè)菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸—生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上,，待瓊脂固化后,，置37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求,。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù),，要比直接作用下的略高。
7.2.7 回變特性—診斷性試驗(yàn)
原理：每種試驗(yàn)菌株對(duì)診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應(yīng)不一,。
鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行,。將受試物換成診斷性誘變劑。
結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)某些診斷性誘變劑*的回變結(jié)果參見表2,。
表2 測(cè)試菌株的回變性
誘變劑 | 劑量(mg) | S9 | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 |
柔毛霉素 氮化鈉 ICR—191 鏈霉黑素 絲列霉素C 2,4,7-三硝基-9-芴酮 4-硝基-O-次苯二胺 4-硝基喹啉-N-氧化物 甲基磺酸甲酯 2-氨基芴 苯并（a）芘 | 6.0 1.5 1.0 0.25 0.5 0.20 20 0.5 1.0 10 1.0 | - - - - - - - - - + + | 124 76 1640 inh inh 8377 2160 528 174 1742 337 | 3123 3 63 inh inh 8244 1599 292 23 6194 143 | 47 3000 185 inh inh 400 798 4220 2730 3026 937 | 592 188 0 2230 2772 16 0 287 6586 261 255 |
注：inh表示抑菌,。表中數(shù)值均已扣除溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)。
8 大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備
8.1 誘導(dǎo)
廣泛應(yīng)用的大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物）,，選擇健康雄性大鼠體重200g左右,，一次腹腔注射誘導(dǎo)劑，劑量為500mg/kg體重,。誘導(dǎo)劑溶于玉米油中,，濃度為200mg/mL。苯八比比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導(dǎo)劑,。
動(dòng)物誘導(dǎo)后第五日斷頭處死,。處死前12h停止飲食，但可自由飲水,。首先，用75%酒精消毒動(dòng)物皮毛，剖開腹部,。在無菌條件下,，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織,，用冰浴的0.15mol/L溶液淋洗肝臟,，放入盛有0.15mol/L氯化甲溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化甲溶液3mL,。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿,，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下,，以9000g離心10min,，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL,。儲(chǔ)存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用,。
上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械,、器皿等,，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后,，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定,。
9 溶劑的選擇
如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑,；如為脂溶性,，應(yīng)選擇對(duì)試驗(yàn)菌株毒性低且無致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）,、丙酮,、95%乙醇。一般操作中,，為了減少誤差和溶劑的影響,，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100ml,。
10 劑量的設(shè)計(jì)
決定受試物高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)細(xì)菌的毒性及其溶解度,。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少,，都是毒性的標(biāo)志,。
對(duì)原料而言，一般高劑量組可為5mg/皿,。對(duì)產(chǎn)品而言,，有殺菌作用的受試物,，高劑量可為低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物,，高劑量可為原液,。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè)劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板,。
11 試驗(yàn)操作步驟
11.1 增菌培養(yǎng)
取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL,，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi),，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h,。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1～2×109活菌數(shù)。
11.2 平板摻入法
實(shí)驗(yàn)時(shí),，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中,，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1mL,，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時(shí)）,，充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上,，轉(zhuǎn)動(dòng)平板,，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后,，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h,。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
實(shí)驗(yàn)中,，除設(shè)受試物各劑量組外,，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照,、陽性誘變劑對(duì)照和無菌對(duì)照,。
12 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變）,、溶劑對(duì)照以及陽性誘變劑對(duì)照的每皿回變菌落數(shù),，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上,，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者,，則該受試物判定為致突變陽性。
受試物經(jīng)上述四個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后,，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株,，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報(bào)告該受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性,。如果受試物經(jīng)四個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后,，無論加S9和未加S9均為陰性,，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。
13 試驗(yàn)報(bào)告
試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：
（1）受試物名稱,、理化性狀,、配制方法、使用溶劑,；
（2）試驗(yàn)菌株：所用試驗(yàn)菌株；
（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導(dǎo)劑,；
（4）試驗(yàn)方法：簡(jiǎn)述操作步驟,，除受試物劑量分組外，還應(yīng)說明空白對(duì)照,、溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照,，
陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；
（5）結(jié)果：以列表方式報(bào)告受試物的Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）,；
（6）結(jié)論,。
表1 Ames試驗(yàn)菌株的回變結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）
組別 | 劑量 (mg/皿) | TA97 -( S9) +( S9) | TA98 -( S9) +( S9) | TA100 -( S9) +( S9) | TA102
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受試物 |
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自發(fā)回變 |
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溶劑對(duì)照 |
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陽性物對(duì)照 |
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Ames試劑盒
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)Ames試驗(yàn)開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備,、誘導(dǎo) S9 制備,、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間,，可以直接使用,，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，無雜菌污染,，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,、可靠,、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應(yīng)用廣泛,，可進(jìn)行食品與飲用水,、化學(xué)品、洗滌劑,、消毒劑,、食品添加劑、藥物殘留,、化妝品,、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。
包裝盒 | 產(chǎn)品組成 | v5.1（4菌） | V5.2（5菌） | 使用說明 | 保存條件 | ||
規(guī)格 | 數(shù)量 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | ||||
A盒 | 瓊脂粉Agar | 66g | 1 | 80g | 1 |
| 室溫
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底層培養(yǎng)基GS | 100mL | 1 | 100mL | 1 | 使用前混勻 | ||
氯化鈉 | 3g | 1 | 3g | 1 |
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2-氨基芴 | 1mL | 1 | 1mL | 1 | 200μg/mL,，使用前混勻 | ||
甲基磺酸甲酯 | 1mL | 1 | 1mL | 1 | 使用前加1 mL滅菌蒸餾水混勻,，濃度10μL/mL | ||
地克松 | 1mL | 1 | 1mL | 1 | 500μg/mL,，使用前混勻 | ||
疊氮鈉 | / | / | 0.5mL | 1 | 15μg/mL，使用前混勻 | ||
2-氨基蒽 | / | / | 0.5mL | 1 | 20μg/mL,，使用前混勻 | ||
S9反應(yīng)液 | 42mL | 1 | 42mL | 1 | 使用前混勻 | ||
底層培養(yǎng)基VS | 100mL | 1 | 100mL | 1 | 使用前混勻 | ||
B盒 | HB溶液 | 2.5mL | 1 | 2.5mL | 1 | 使用前混勻 | -80℃下長(zhǎng)期保存,，可保存6個(gè)月。-20℃可短期保存3周,。請(qǐng)勿反復(fù)凍融,。 |
1,8-二羥基蒽醌 | 0.5mL | 1 | 0.5mL | 1 | 1mg/mL，使用前混勻 | ||
S9 混合物 | 1.4mL | 5 | 1.4mL | 6 | 使用前加2.86 mL冰冷滅菌蒸餾水復(fù)溶 | ||
TA97菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | 使用前混勻 | ||
TA98菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | |||
TA100菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | |||
TA102菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | |||
TA1535菌株 | / | / | 5.0mL | 1 | |||
1. 誘導(dǎo) S9 采用先進(jìn)無菌凍干干燥工藝制成,，實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo) S9 酶活性的穩(wěn)定保存,，同時(shí)有效防止了細(xì)菌污染。實(shí)驗(yàn)時(shí)用 S9 反 應(yīng)液溶解混勻,。
2. 實(shí)驗(yàn)菌株采用先進(jìn)工藝規(guī)?；苽洌鰪S前經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，低溫貯存條件確保了實(shí)驗(yàn)菌株的長(zhǎng)期穩(wěn)定性,。實(shí)驗(yàn)時(shí)混 勻后即可直接使用，節(jié)省了菌株鑒定,、活化處理以及菌液濃度調(diào)整等時(shí)間,。
3. 實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照試劑種類覆蓋整個(gè) Ames 實(shí)驗(yàn)要求，在添加和不添加 S9 的情況下均可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)菌株呈現(xiàn)陽性反應(yīng),。陽性對(duì)照 試劑采購(gòu)自*公司,，按照 Ames 實(shí)驗(yàn)需求精準(zhǔn)定量分 裝，出廠前經(jīng)過實(shí)驗(yàn)檢測(cè),，陽性對(duì)照試劑的長(zhǎng)期穩(wěn)定性有質(zhì)量 保證,。
4. 底層培養(yǎng)基 VS、GS 以干粉形式提供,，便于培養(yǎng)基長(zhǎng)期穩(wěn)定 保存,。使用前只需添加蒸餾水滅菌處理即可，試劑瓶采用耐高 溫材料,，因此可以直接向試劑瓶中添加所需劑量的蒸餾水,。
5. 頂層培養(yǎng)基 HB 凍干球采用先進(jìn)無菌凍干干燥工藝制成，使用前需先用滅菌蒸餾水溶解,，然后用 0.22μm 濾膜過濾除菌,。
試劑盒應(yīng)用范圍
本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣，可進(jìn)行食品與飲用水,、化學(xué)品,、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑,、藥物殘留,、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學(xué)檢測(cè),。
傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作不足
周期長(zhǎng)——培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備,、誘導(dǎo) S9 制備、菌株鑒定,、菌株培養(yǎng) 等耗費(fèi)大量時(shí)間,。 穩(wěn)定性差——雜菌污染、活菌數(shù)不符合要求,、實(shí)驗(yàn)試劑配制不準(zhǔn) 確等都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗,。
試劑盒優(yōu)勢(shì)
便捷—— 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備,、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間,，可以直接使用,，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。 準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，無雜菌污染,， 菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,、可靠,、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng),、易于運(yùn)輸和保存,。
試劑盒使用操作流程
1. 實(shí)驗(yàn)器材、試劑準(zhǔn)備：三角瓶,、5mL 或 15mL 試管,、100μl 和1000μl 槍頭、0.22μm 濾膜,、注射器,、平皿、二甲基亞砜,、滅菌 蒸餾水等,；
2. 設(shè)置待測(cè)物劑量，配制各劑量無菌待測(cè)物溶液,；
3. VS,、GS 培養(yǎng)基加水溶解并滅菌，配制底層培養(yǎng)基,；
4. HB 球加滅菌蒸餾水溶解,，充分混勻,，然后過濾除菌；
5. 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天配制頂層培養(yǎng)基,，2ml 分裝,，然后 45℃水浴保溫；
6. 用無菌蒸餾水溶解 S9 復(fù)合物并配制 S9 反應(yīng)混合液,；
7. 開展 Ames 實(shí)驗(yàn),，將 2mL 頂層培養(yǎng)基+100μL 菌液+100μL 待測(cè) 物或陽性底物+500μL10% S9 混合液混勻，傾倒于底層培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)室溫度低時(shí)傾倒的頂層培養(yǎng)基易冷凝,，可將底層培養(yǎng)基 放置于 37℃培養(yǎng)箱一段時(shí)間,，然后再傾倒頂層培養(yǎng)基）；
8. 待頂層培養(yǎng)基冷凝后,，將實(shí)驗(yàn)平皿放入 37℃培養(yǎng)箱,，培養(yǎng) 48h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
試驗(yàn)方法
試驗(yàn)方法主要是平板摻入法和預(yù)培養(yǎng)平板摻入法,，具體操作如下：
1. 平板摻入法
a) 準(zhǔn)備所需底層培養(yǎng)基平皿若干,。
b) 融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2 mL,，在45℃水 浴中保溫,。
c) 在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測(cè)試菌株菌液0.1 mL，混 勻,；加受試物0.05 mL~ 0.2 mL（一般加入0.1 mL,。需活化時(shí) 另外再加入10 % S9反應(yīng)混合液 0.5 mL），再混勻,，然后迅 速傾入底層培養(yǎng)基上,。轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布 在底層上,，平放固化,，37℃ 培養(yǎng) 48 h觀察結(jié)果。
d) 另做一陽性對(duì)照,、溶劑對(duì)照和未處理對(duì)照,。陽性對(duì)照不加 受試物，只加標(biāo)準(zhǔn)誘變劑（即試劑盒陽性對(duì)照試劑,，見表2）,；溶劑對(duì)照加除受試物和標(biāo)準(zhǔn)誘變劑以外的所有試劑， 如溶劑二甲基亞砜等（光譜純或分析純）,；未處理對(duì)照只 在培養(yǎng)基上加菌液,；其他方法同上。
2. 預(yù)培養(yǎng)平板摻入法 預(yù)培養(yǎng)對(duì)于某些受試物可取得較好效果。因此可根據(jù)情況確定 是否進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),。在加入頂層瓊脂前,，先進(jìn)行以下預(yù)培養(yǎng)步
驟：在試驗(yàn)中，將受試物（需活化時(shí)另加入10% S9反應(yīng)混合 液）和菌液,，在37℃中培養(yǎng)20min,，或在30℃中培養(yǎng)30min，然 后再加2mL頂層瓊脂,，其他同上述平板摻入法,。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)及受試物的特殊處理
1) 劑量設(shè)計(jì) 決定受試物高劑量的原則是受試物對(duì)試驗(yàn)菌株的毒性和受試物的溶解度。對(duì)于純的化學(xué)物質(zhì),，一般低劑量為每平皿0.2 μg,，高劑量為 5 mg，或溶解度允許,，或飽和濃度,，或?qū)?xì)菌產(chǎn)生小毒性濃度。對(duì)于毒性很低,、攝入量很大的定型產(chǎn)品,，可根據(jù)其溶解度和對(duì)細(xì)菌的毒性采用可能的大劑量。每 種受試物在允許高劑量下設(shè)4個(gè)（含4個(gè)）以上劑量,，每劑量間隔不超過5倍，每個(gè)劑量應(yīng)做三個(gè)平皿,。
2) 溶劑 溶劑可選用水,、二甲基亞砜或其他溶劑（溶劑劑量應(yīng)限定在毒性劑量以下。以二甲基亞砜為例,，平板摻入法每皿不超過0.1mL 溶劑,；預(yù)培養(yǎng)平板摻入法每皿不超過0.01mL 溶劑）， 無論選用什么溶劑均應(yīng)無誘變性,。
3) 對(duì)照組的設(shè)置 試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)有陽性物對(duì)照組,、溶劑對(duì)照組和未處理對(duì)照，均 包括加S9和不加S9兩種情況,。
4) 受試物的特殊處理 若遇特殊受試物作非常規(guī)處理時(shí)應(yīng)在報(bào)告中說明,。對(duì)以下幾種情況可作如下處理：
a) 含組氨酸受試物：根據(jù)食品中測(cè)得的組氨酸含量若能誘發(fā) 回復(fù)突變率的增高可加設(shè)組氨酸平行對(duì)照組；或?qū)z品經(jīng)XAD-II樹脂柱過濾洗脫預(yù)處理,。
b) 食品包裝材料及其制品成分：根據(jù)材料或制品的組成成 分,，可分別采取過篩抽提、蒸發(fā)殘?jiān)燃夹g(shù)處理,。
c) 揮發(fā)性受試物：可采用真空干燥器處理等方法,。
d) 天然植物材料：可按植物化學(xué)方法制備粗制品或純制品。
結(jié)果的判定
以直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生 長(zhǎng)良好條件下,，受試物組回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的 兩倍或兩倍以上,，并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測(cè)試點(diǎn)有可重 復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性反應(yīng)，即可認(rèn)為該受試物誘變?cè)囼?yàn) 陽性,。受試物經(jīng)上述四個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后,，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌 株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性,，均可報(bào)告該受試物對(duì) 鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性,。如果受試物經(jīng)四個(gè)試驗(yàn)菌株檢 測(cè)后，無論加S9和未加S9均為陰性,，則可報(bào)告該受試物為致突 變陰性,。
Ames 實(shí)驗(yàn)報(bào)道文獻(xiàn)舉例
廣東省疾病預(yù)防控制中心通過 Ames 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分染發(fā)劑引起試驗(yàn) 菌株 TA97、TA98,、TA100 回變率明顯升高,，提示部分染發(fā)類 產(chǎn)品具有致突變作用，可對(duì)健康產(chǎn)生危害,。何冬梅等,、中 國(guó) 衛(wèi) 生檢驗(yàn)雜志 2007,17,(11)。
人參與女貞子是臨床上常見的有一定抗腫瘤效果的補(bǔ)益中藥,，在 Ames 試驗(yàn)中人參能抑制二氨基芴引起的 TA98 菌株回變菌落數(shù)的增加,；女貞子能抑制疊氮鈉引起的 TA100 菌株回變菌落數(shù)的增加，分別表現(xiàn)出抗移碼型突變和抗堿基置換型突變的作用,。倪婭等,、中國(guó)保健 2009,17,(17)。生活飲用水經(jīng)投加二氧化氯處理后對(duì)水中石油類污染物具有較 強(qiáng)的去除作用,，可使水中有毒有害有致癌性的物質(zhì)氧化降解為 毒性較小,、無致癌作用的小分子物質(zhì)，并且致突變活性明顯降低,，Ames 值由陽性轉(zhuǎn)為陰性,。高慶然等、工業(yè)用水與廢水2001,6,。
喹烯酮是我國(guó)自主研發(fā)的喹噁啉類一類新獸藥,，作為抗菌促生 長(zhǎng)劑用于豬飼料中， Ames 試驗(yàn)表明喹烯酮對(duì) TA97,、TA98,、 TA100 和 TA1537 加和不加 S9 在一定劑量下均為陽性。結(jié)果提 示,，喹烯酮存在一定致突變毒性,，應(yīng)制定高殘留*,。張偉 等、毒理學(xué)雜志 2007,04,。
Ames 試驗(yàn)表明煤和液化石油氣（LPG）燃燒顆粒物均具有很強(qiáng) 的直接和間接致突變作用,，主要致突變作用來源于硝基和胺基多環(huán)芳烴，兩種顆粒物同時(shí)存在可加大致癌風(fēng)險(xiǎn),。閆洪濤等,、 中國(guó)公共衛(wèi)生 2007,04。
烷基酚聚氧乙烯醚（APES） 是一大類表面活性劑家族,，廣泛 用于家庭和工業(yè)的清潔產(chǎn)品,，烷基酚類化合物是其降解產(chǎn)物， 其中對(duì)甲基苯酚,、2,6-二甲基苯酚,、4-乙基苯酚、4-辛基苯酚,、對(duì)壬基苯酚,、4-硝基苯酚、2-氯苯酚,、1,3-二氯苯酚,、2,4-二氯 苯酚、2,6-二氯苯酚,、三氯苯酚和 2,3,5,6-四氯苯酚 12 種化合物 的 Ames 試驗(yàn)表明除 2,4- 二氯苯酚未誘發(fā)各菌株的陽性反應(yīng)外,，其余 11 種待測(cè)物均誘發(fā)了陽性反應(yīng),說明這 11 種苯酚類化 合物均具有致突變性。楊麗等,、東北師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）
2003,01,。
重組葡糖激酶作為一種生物技術(shù)藥物具有明顯的溶栓和抗凝效果，Ames 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組葡糖激酶對(duì)試驗(yàn)菌株 TA97 ,、TA98、TA100 和 TA102 無誘發(fā)回變作用,。劉永學(xué)等,、癌變·畸變·突變 2004,9。
常見問題及原因分析
1,、自發(fā)回變數(shù)顯著低于標(biāo)準(zhǔn) 原因：a. 試劑盒保存條件不合適,，菌株失活或營(yíng)養(yǎng)成分降解；b.培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸,、生物素添加量低,；c.操作過程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過高；
2,、自發(fā)回變數(shù)顯著高于標(biāo)準(zhǔn) 原因：a. 培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸,、生物素添加量高,；b.培養(yǎng)皿經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒不*或環(huán)氧乙烷有殘留；
3,、陽性底物誘變菌落數(shù)偏離標(biāo)準(zhǔn)范圍 原因：a. 陽性底物溶解不*或未充分混勻,；b. 陽性底物添加量不準(zhǔn)確；c. 試劑盒保存條件不合適或過期,，陽性底物降解或 S9失活,；d. 操作過程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過高；
4,、待測(cè)物誘變菌落數(shù)非常低或沒有菌落 原因：a. 待測(cè)物或待測(cè)物溶劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有毒性,；b. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9 失活,； c. 操作過程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過高,；
5、菌落分布不均勻,，集中偏向一側(cè),。原因： 倒底層或頂層培養(yǎng)基時(shí)平皿未水平放置；
6,、頂層或底層培養(yǎng)基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 頂層或底層培養(yǎng)基中瓊脂粉含量低,；b. 頂層培養(yǎng)基中加入的溶劑或待測(cè)物酸化，導(dǎo)致凝膠不充分,；
7,、如何判斷 Ames 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否為假陽性 將經(jīng)受試物和陽性對(duì)照物處理的 Ames 菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)后接種于無組氨酸的培養(yǎng)基上,觀察比較細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。如果經(jīng)受試 物處理的菌株不能生長(zhǎng)在無組氨酸的培養(yǎng)基中,而經(jīng)陽性對(duì)照物處 理的菌株則可以生長(zhǎng)在無組氨酸的培養(yǎng)基上,則說明經(jīng)受試物處理 的菌株沒有發(fā)生突變,，試驗(yàn)中所觀察到的菌落數(shù)增加是假陽性,。
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