快速可靠的分析是工藝開發(fā)過程中的關(guān)鍵。外泌體工藝開發(fā)的過程監(jiān)控也是一大挑戰(zhàn)。各類囊泡的尺寸都超出了體積排阻色譜的分辨范圍,。外泌體吸收很少的紫外線,，這使得它們難以從有更豐富和更強(qiáng)的吸收紫外線能力的宿主蛋白質(zhì)和DNA（尤其是以殘留染色質(zhì)的形式）中進(jìn)行色譜檢測和區(qū)分,，特別是以殘余染色質(zhì)的形式,。

外泌體和其他囊泡類型是復(fù)合脂質(zhì)膜組合體，并含有自身的核酸和多種蛋白質(zhì),。它們在很寬的分子量范圍內(nèi)產(chǎn)生會多個不同強(qiáng)度的條帶,，這使得不同囊泡類型之間的電泳條帶很難區(qū)分，尤其是在污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的背景下,。其中一些阻礙可以克服,，但這需要時間。

對于外泌體特異性抗原,，可以通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）增強(qiáng)電泳,，但這很費力，需要將測定時間增加到至少兩天,。ELISA 可以自動化以增加通量,，但仍然需要將近兩天的時間。斑點印跡法（Dot-blotting）缺乏Western blotting和 ELISA 的靈敏度和特異性,，并且仍然需要一天中的黃金時間,。此外，建立高質(zhì)量的抗體庫這本身就是一個項目,。這些額外的要求大大增加了分析負(fù)擔(dān),，也會往往阻礙對純化選項的深入探究,。

BIA本系列的三篇文章聚焦于外泌體分析純化的挑戰(zhàn),。本文是該系列的第二篇，介紹可實現(xiàn)外泌體在線色譜檢測的新分析方法,。一種方法可以將細(xì)胞外囊泡與非囊泡污染物區(qū)分來,，一種方法有可能將外泌體與其他囊泡區(qū)分開來。示例說明了如何能夠開發(fā)更有效和更有據(jù)可查的純化方法,。
 

外泌體過程監(jiān)測的新分析方法：

在線 SEC-MALS/UV

然而需要強(qiáng)調(diào)的是,，該峰不僅僅由外泌體組成：它包含所有細(xì)胞外囊泡和高分子量聚集體，還可能進(jìn)一步包括病毒、脂質(zhì)-脂蛋白結(jié)合和細(xì)胞碎片,。然而,，MALS 使得一些只能通過UV吸光度法微弱地檢測到的產(chǎn)物群體變得可見。MALS 還可用于獲取有關(guān)峰內(nèi)產(chǎn)物大小分布的信息,。為了提供有關(guān)任何單一產(chǎn)物大小的有效信息,，它必須以純化合物的形式被洗脫。
 

 混合物產(chǎn)生的結(jié)果表示組分的平均大小,，根據(jù)每個組分在整個樣本中所占的比例進(jìn)行重量平均,，但 MALS 仍然可以提供有用的信息。圖2將部分純化外泌體制備物的SEC實驗中的旋轉(zhuǎn)半徑圖與散射強(qiáng)度進(jìn)行了對比,。請注意,，表觀尺寸通過空隙峰的前側(cè)迅速下降，表明較大的產(chǎn)物在該區(qū)域富集,。峰的其余部分似乎由與外泌體大小范圍相同的產(chǎn)物組成,。應(yīng)該理解的是該圖中較大顆粒的尺寸大小因為它們與較小顆粒混合而被低估了,，而較小顆粒的尺寸由于它們與較大顆粒的混合而被高估了,，但是對于說明它們相對的分布情況仍然非常有用。純物質(zhì)的尺寸分布往往產(chǎn)生水平的半徑圖,。

 SEC-MALS/FLD 聯(lián)合免疫熒光

蛋白免疫印跡分析但其速度慢,、勞動密集和非定量的局限性嚴(yán)重加重了純化工藝開發(fā)和生產(chǎn)制造流程的負(fù)擔(dān),。

將 MALS 與梯度色譜方法相結(jié)合,，可以在色譜圖上直接顯示囊泡，并進(jìn)行定量檢測,，無需額外的時間和勞動力,。進(jìn)一步整合熒光增加了免疫學(xué)確認(rèn)以及 MALS 的大小區(qū)分。即使使用 MALS/IF-SEC 對分?jǐn)?shù)進(jìn)行二次評估,，也可以比從蛋白印跡分析更快的獲得結(jié)果,，并且它們是定量的。

這些新的分析工具,，使得探索外泌體純化技術(shù)變得可行,，這些技術(shù)比用于實現(xiàn)外泌體富集和宿主細(xì)胞污染物減少的基本方法有更高的能力。

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本文來源：BIA Separations

一直以來,，BIA Separations是具有質(zhì)粒DNA、AAV,、mRNA高效率純化,。不僅提供整體柱及平臺方法，還提供定制的純化服務(wù),，以滿足質(zhì)粒DNA,、AAV、mRNA規(guī)?；a(chǎn)的純化需求,。

陰離子交換色譜的效用也表明陽離子交換色譜應(yīng)該也是有用的。蛋白印跡分析表明一些外泌體結(jié)合而另一些則不結(jié)合（未顯示）,。陰離子交換和陽離子交換結(jié)果均可通過系統(tǒng)修改柱平衡和洗脫條件進(jìn)行調(diào)整,。疏水相互作用層析和其他梯度方法擴(kuò)展了選擇范圍。將這些方法中的任何一種與 MALS 相結(jié)合,，可以大大簡化為實現(xiàn)特定分離而進(jìn)行的發(fā)掘和優(yōu)化任務(wù),。

遺憾的是，IF 不能與梯度色譜法聯(lián)合使用,?？贵w和與其偶聯(lián)的熒光團(tuán)具有強(qiáng)電荷和疏水性特征。結(jié)合到囊泡表面后免疫偶聯(lián)物可以影響囊泡保留,。在大多數(shù)情況下,，這會導(dǎo)致標(biāo)記的囊泡在與抗體偶聯(lián)物相同的位置洗脫。只有尺寸排阻色譜（SEC）支持IF檢測,，但這種情況下也不理想,。

從邏輯上講,，結(jié)合到囊泡外部會產(chǎn)生更大尺寸的復(fù)合物。因為囊泡主要在大小區(qū)分為零的空隙體積中洗脫,，所以效果是可以容忍的,，至少對于使用小合成熒光團(tuán)的免疫偶聯(lián)物而言是這樣。使用大蛋白熒光團(tuán)如藻紅蛋白 (240 kDa) 的偶聯(lián)物可能會掩蓋對于小熒光團(tuán)偶聯(lián)物來說會很明顯區(qū)分的囊泡大小的差異,。