快速可靠的分析是工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵,。外泌體工藝開(kāi)發(fā)的過(guò)程監(jiān)控也是一大挑戰(zhàn)。各類(lèi)囊泡的尺寸都超出了體積排阻色譜的分辨范圍,。外泌體吸收很少的紫外線(xiàn),，這使得它們難以從有更豐富和更強(qiáng)的吸收紫外線(xiàn)能力的宿主蛋白質(zhì)和DNA（尤其是以殘留染色質(zhì)的形式）中進(jìn)行色譜檢測(cè)和區(qū)分，特別是以殘余染色質(zhì)的形式,。

外泌體和其他囊泡類(lèi)型是復(fù)合脂質(zhì)膜組合體,，并含有自身的核酸和多種蛋白質(zhì)。它們?cè)诤軐挼姆肿恿糠秶鷥?nèi)產(chǎn)生會(huì)多個(gè)不同強(qiáng)度的條帶,，這使得不同囊泡類(lèi)型之間的電泳條帶很難區(qū)分,，尤其是在污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的背景下,。其中一些阻礙可以克服,，但這需要時(shí)間,。

對(duì)于外泌體特異性抗原，可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）增強(qiáng)電泳,，但這很費(fèi)力,，需要將測(cè)定時(shí)間增加到至少兩天。ELISA 可以自動(dòng)化以增加通量,，但仍然需要將近兩天的時(shí)間,。斑點(diǎn)印跡法（Dot-blotting）缺乏Western blotting和 ELISA 的靈敏度和特異性，并且仍然需要一天中的黃金時(shí)間,。此外,，建立高質(zhì)量的抗體庫(kù)這本身就是一個(gè)項(xiàng)目。這些額外的要求大大增加了分析負(fù)擔(dān),，也會(huì)往往阻礙對(duì)純化選項(xiàng)的深入探究,。

BIA本系列的三篇文章聚焦于外泌體分析純化的挑戰(zhàn)。本文是該系列的第二篇,，介紹可實(shí)現(xiàn)外泌體在線(xiàn)色譜檢測(cè)的新分析方法,。一種方法可以將細(xì)胞外囊泡與非囊泡污染物區(qū)分來(lái)，一種方法有可能將外泌體與其他囊泡區(qū)分開(kāi)來(lái),。示例說(shuō)明了如何能夠開(kāi)發(fā)更有效和更有據(jù)可查的純化方法,。
 

外泌體過(guò)程監(jiān)測(cè)的新分析方法：

在線(xiàn) SEC-MALS/UV

然而需要強(qiáng)調(diào)的是,，該峰不僅僅由外泌體組成：它包含所有細(xì)胞外囊泡和高分子量聚集體,，還可能進(jìn)一步包括病毒,、脂質(zhì)-脂蛋白結(jié)合和細(xì)胞碎片。然而,，MALS 使得一些只能通過(guò)UV吸光度法微弱地檢測(cè)到的產(chǎn)物群體變得可見(jiàn),。MALS 還可用于獲取有關(guān)峰內(nèi)產(chǎn)物大小分布的信息,。為了提供有關(guān)任何單一產(chǎn)物大小的有效信息,，它必須以純化合物的形式被洗脫,。
 

 混合物產(chǎn)生的結(jié)果表示組分的平均大小,，根據(jù)每個(gè)組分在整個(gè)樣本中所占的比例進(jìn)行重量平均,，但 MALS 仍然可以提供有用的信息。圖2將部分純化外泌體制備物的SEC實(shí)驗(yàn)中的旋轉(zhuǎn)半徑圖與散射強(qiáng)度進(jìn)行了對(duì)比,。請(qǐng)注意，表觀(guān)尺寸通過(guò)空隙峰的前側(cè)迅速下降,，表明較大的產(chǎn)物在該區(qū)域富集。峰的其余部分似乎由與外泌體大小范圍相同的產(chǎn)物組成,。應(yīng)該理解的是該圖中較大顆粒的尺寸大小因?yàn)樗鼈兣c較小顆?；旌隙坏凸懒?，而較小顆粒的尺寸由于它們與較大顆粒的混合而被高估了，但是對(duì)于說(shuō)明它們相對(duì)的分布情況仍然非常有用,。純物質(zhì)的尺寸分布往往產(chǎn)生水平的半徑圖。

 SEC-MALS/FLD 聯(lián)合免疫熒光

蛋白免疫印跡分析但其速度慢,、勞動(dòng)密集和非定量的局限性嚴(yán)重加重了純化工藝開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)制造流程的負(fù)擔(dān)。

將 MALS 與梯度色譜方法相結(jié)合,，可以在色譜圖上直接顯示囊泡,，并進(jìn)行定量檢測(cè)，無(wú)需額外的時(shí)間和勞動(dòng)力,。進(jìn)一步整合熒光增加了免疫學(xué)確認(rèn)以及 MALS 的大小區(qū)分,。即使使用 MALS/IF-SEC 對(duì)分?jǐn)?shù)進(jìn)行二次評(píng)估，也可以比從蛋白印跡分析更快的獲得結(jié)果,，并且它們是定量的,。

這些新的分析工具，使得探索外泌體純化技術(shù)變得可行,，這些技術(shù)比用于實(shí)現(xiàn)外泌體富集和宿主細(xì)胞污染物減少的基本方法有更高的能力,。

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本文來(lái)源：BIA Separations

一直以來(lái),，BIA Separations是具有質(zhì)粒DNA,、AAV、mRNA高效率純化,。不僅提供整體柱及平臺(tái)方法,，還提供定制的純化服務(wù)，以滿(mǎn)足質(zhì)粒DNA,、AAV,、mRNA規(guī)模化生產(chǎn)的純化需求,。

陰離子交換色譜的效用也表明陽(yáng)離子交換色譜應(yīng)該也是有用的,。蛋白印跡分析表明一些外泌體結(jié)合而另一些則不結(jié)合（未顯示）,。陰離子交換和陽(yáng)離子交換結(jié)果均可通過(guò)系統(tǒng)修改柱平衡和洗脫條件進(jìn)行調(diào)整。疏水相互作用層析和其他梯度方法擴(kuò)展了選擇范圍,。將這些方法中的任何一種與 MALS 相結(jié)合,，可以大大簡(jiǎn)化為實(shí)現(xiàn)特定分離而進(jìn)行的發(fā)掘和優(yōu)化任務(wù)。

遺憾的是,，IF 不能與梯度色譜法聯(lián)合使用,。抗體和與其偶聯(lián)的熒光團(tuán)具有強(qiáng)電荷和疏水性特征,。結(jié)合到囊泡表面后免疫偶聯(lián)物可以影響囊泡保留,。在大多數(shù)情況下，這會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的囊泡在與抗體偶聯(lián)物相同的位置洗脫,。只有尺寸排阻色譜（SEC）支持IF檢測(cè),，但這種情況下也不理想。

從邏輯上講,，結(jié)合到囊泡外部會(huì)產(chǎn)生更大尺寸的復(fù)合物,。因?yàn)槟遗葜饕诖笮^(qū)分為零的空隙體積中洗脫，所以效果是可以容忍的,，至少對(duì)于使用小合成熒光團(tuán)的免疫偶聯(lián)物而言是這樣,。使用大蛋白熒光團(tuán)如藻紅蛋白 (240 kDa) 的偶聯(lián)物可能會(huì)掩蓋對(duì)于小熒光團(tuán)偶聯(lián)物來(lái)說(shuō)會(huì)很明顯區(qū)分的囊泡大小的差異。