色譜載體的類型（整體柱、樹脂、膜等）,、固相載體介質(zhì)和使用的流動相,，都會影響到分離成功與否。選擇正確的工具和條件組合會帶來想要的結(jié)果,。然而,，還有其他因素，如柱溫,、流動相制備的準(zhǔn)確性以及最重要的柱平衡,，這些因素對于最佳分離至關(guān)重要，但很容易被忽視,，尤其是最后一個因素,。

PrimaS和QA介質(zhì)采用梯度洗脫（分別為電導(dǎo)率和pH值）方式來分離空衣殼和實衣殼。由于這種分離是基于兩者之間微小的衣殼差異,，因此會對色譜參數(shù)的微小變化很敏感,。尤其是如果整個過程由多人操作時，其中一些參數(shù)可能不明顯且分析后難以確定,。為了建立認(rèn)知,，本文使用PrimaS介質(zhì)作為模型評估了其中的幾個因素。此外,，本文還說明了為什么使用電導(dǎo)率和 pH檢測器對于理解樣品結(jié)果之間的不一致性非常重要,。

這些結(jié)果也可考慮應(yīng)用于QA介質(zhì)及其他介質(zhì)，然而結(jié)果會有一定程度的變化,。

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實驗方法

使用0.2 mL PrimaS^TM整體柱進(jìn)行方法開發(fā),，用AAV 2/8血清型樣本進(jìn)行檢測。為了評估色譜參數(shù),，從色譜圖中獲取空衣殼和實衣殼的保留時間和洗脫pH值向樣品中加入色氨酸,，將其作為一種非結(jié)合示蹤劑（流穿峰）。

PATfix® HPLC系統(tǒng)用于色譜實驗

檢測器：

• pH和電導(dǎo)率

• 熒光（Ex/Em：280/348 nm）

緩沖液組成（pH梯度）：

• 緩沖液A：10 mM BTP,、10 mM（TRIS）,、2 mM氯化鎂（MgCl₂）、1%山梨醇,、0.1% poloxamer188,，pH 8.00

• 緩沖液B：10 mM BTP、10 mM（TRIS）,、10 mM氯化鈉（NaCl）,、2 mM 氯化鎂（MgCl₂）、1%山梨醇,、0.1% poloxamer188,，pH 9.50

梯度：從100%緩沖液A到100%緩沖液B，5.0分鐘梯度。

CIP和柱平衡：10 CV 0.1 M（NaOH）和1 M氯化鈉（NaCl）,；30 CV 0.1 M乙酸和1 M氯化鈉，pH 5,；20 CV雙蒸水（ddH2O）,；20 CV緩沖液A；20 CV緩沖液B,；40 CV緩沖液A

結(jié)果
 

溫度變化對空衣殼（E）/ 實衣殼（F）分離的影響:

 圖1: 在23℃,、26℃和30℃三種不同溫度下進(jìn)行的AAV空衣殼/實衣殼分離的色譜圖

溫度升高會顯著提高空衣殼和實衣殼之間的分辨率，但也會影響保留時間（圖 1）,。雖然潛在的機制很多,，但較高的溫度確實會增加分子動能，進(jìn)而影響分子-分子和分子-整體柱相互作用,。

為了成功應(yīng)用,，需了解AAV結(jié)合特性（電導(dǎo)率、pH,、T）并保持溫度穩(wěn)定,。使用柱溫箱對于提供可重現(xiàn)的色譜柱性能至關(guān)重要。然而我們在使用制備柱時確實需要注意這一點,，它對于可重現(xiàn)性分析至關(guān)重要,。

如果要將緩沖液置于恒溫箱中，則可對其進(jìn)行預(yù)熱,，或可以在進(jìn)入色譜柱之前使用金屬線圈進(jìn)行預(yù)熱,。有些緩沖液比其他緩沖液更值得注意，因為它們的pH值容易受溫度影響（如TRIS）,。其他應(yīng)用場景也是如此,，如pDNA同種型分離非常依賴溫度。

還必須控制柱溫,。最重要的是,，冷藏過的色譜柱，應(yīng)該將它預(yù)熱到工作條件,。

使用PrimaS柱時效果可觀,，但在使用CIMac AAV full/empty（QA基質(zhì)）柱時也觀察到效果顯著。

緩沖液制備影響空衣殼/實衣殼分離:

 圖2: 使用pH 8.00±0.05的緩沖液A進(jìn)行AAV空衣殼/實衣殼分離的色譜圖

緩沖液制備對分離性能有影響（圖 2）,。 pH 和電導(dǎo)率都是色譜方法優(yōu)化的關(guān)鍵因素,，因此應(yīng)該嚴(yán)格控制。現(xiàn)有例子顯示了 pH 值變化對分辨率和保留時間的影響,。在某些情況下,，影響可能比圖 2 中觀察到的更大。

雖然如圖所示分析了 pH 值的影響,，但電導(dǎo)率也非常重要,。滴定過程中 pH 值被過度校正（pH 值降到目標(biāo)值以下必須重新調(diào)高）時要注意,。這會增加離子濃度，因此盡管達(dá)到了正確的 pH 值,，但仍增加了電導(dǎo)率,。在這種情況下，丟棄緩沖液并重新開始配制新緩沖液可減少阻礙,。這適用于使用 PrimaS,、QA 和其他基質(zhì)整體柱時。

要了解并控制 pH 值及電導(dǎo)率對色譜分離的影響,，使用 pH 計尤其是電導(dǎo)率檢測器至關(guān)重要,。缺乏此類知識會使我們變得盲目，并在分析不可重現(xiàn)性或其他異?，F(xiàn)象背后原因時很難提供指導(dǎo),。

對于 PrimaS，pH 值的精度必須達(dá)到 1%,，才能獲得可重現(xiàn)的結(jié)果,。這可通過使用精確質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化 的1 M HCl 調(diào)節(jié) pH 值來實現(xiàn)。

柱平衡對空衣殼/實衣殼分離的影響

 圖3: 不同柱平衡條件下進(jìn)行AAV空衣殼/實衣殼分離的色譜圖

在使用制備型色譜或分析型色譜時,，為了獲得可重現(xiàn)的結(jié)果和更大化峰分辨率而采取的較簡單預(yù)防措施,，也是往往被忽視的一種：色譜柱平衡。 很容易觀察到并再次顯示在圖3 中,，如果色譜柱未完全平衡,，峰之間的分辨率會顯著降低。無論是離子交換(QA)色譜柱還是混合模式色譜柱,，如 PrimaS（離子交換與氫鍵結(jié)合）,，為了適當(dāng)?shù)臉悠方Y(jié)合來準(zhǔn)備色譜柱是不可少的。

在進(jìn)行分析時,，電導(dǎo)率和pH檢測器將幫助我們確認(rèn)色譜柱是否已平衡,。最好標(biāo)志是與空白樣品相比，電導(dǎo)率和 pH 信號接近基線,。柱平衡后的推薦步驟是在注入樣品之前上至少 3 個空白樣品（或直到所有信號軌跡在運行之間可重現(xiàn)）,。

對于制備型色譜，這主要取決于柱出口處的 pH 和電導(dǎo)率信號是否與柱前測量值相匹配,。

開始開發(fā)使用色譜柱時嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,。在此過程的后期，可以根據(jù)經(jīng)驗優(yōu)化柱平衡條件（減少特定緩沖液的 CV,，或例如在平衡期間過渡到靜態(tài)保持步驟——沒有流速以節(jié)省緩沖液）,。

值得注意的是需要在原位清洗（CIP）后中和色譜柱，尤其是在使用不同濃度的 NaOH 時。使用 1 M 乙酸鈉或選擇等同強度緩沖液（如在方法本身中使用的緩沖液）,。繼續(xù)用去離子水洗滌,。之后，將平衡緩沖液用于新的色譜運行或用于作為長期儲存的儲存溶液,。此步驟對于獲得最佳柱效至關(guān)重要,。如需精確的分步指導(dǎo)，請搜索隨附的說明手冊,。

系統(tǒng)空隙體積的影響

 圖4: 空衣殼/實衣殼AAV分離色譜圖：基于檢測器dt(pH-FLD)的延遲

空隙體積在解釋和評價色譜參數(shù)時起著重要作用,，特別是在高空隙體積系統(tǒng)上運行小色譜柱時，空隙體積的影響會更加顯著,。圖 4顯示了pH及熒光檢測器的延遲——分析物首先通過pH檢測器,，再通過熒光檢測器,。如果采用檢測器dt(pH-FLD)校正,，則可獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果,。

必須考慮方法進(jìn)程指示信號（例如電導(dǎo)率和 pH 值）與 UV,、熒光或 MALS 信號之間的色譜系統(tǒng)配置延遲,。

結(jié)論

為了在CIMac PrimaS™和CIMac AAV full/empty色譜柱上進(jìn)行可重現(xiàn)性的AAV空衣殼/實衣殼分離，重要的是：

· 控制色譜柱、流動相和樣品溫度,。對于色譜柱和流動相,，請使用恒溫箱,?；蛟谏V柱前使用金屬線圈在流動相流到色譜柱時對其進(jìn)行加熱（這只會加熱緩沖液，對色譜柱本身作用不大）,。進(jìn)樣前恒溫樣品。

· 準(zhǔn)備緩沖液時要注意精度,。設(shè)置可接受的誤差以減少不受控制的波動,。

· 平衡色譜柱,。好的起點是遵循應(yīng)用手冊并根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行優(yōu)化,。

· 考慮色譜配置條件并考慮在信號上觀察到的任何延遲,。

一直以來,，BIA Separations是質(zhì)粒DNA,、AAV、mRNA高效率純化,。不僅提供整體柱及平臺方法,，還提供定制的純化服務(wù)，以滿足質(zhì)粒DNA,、AAV,、mRNA規(guī)模化生產(chǎn)的純化需求,。