多肽合成方法：
1.?；B氮物法
早在1902年，Theodor Curtius就將?；B氮物法引入到肽化學(xué)中,，因此它是最古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中,，除了與?；B氨縮合的游離氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有機(jī)溶劑中,。與其他許多縮合方法不同的是,，它不需要增加輔助堿或另一等當(dāng)量的氨基組分來捕獲腙酸。
長期以來,，一直認(rèn)為疊氮物法是不發(fā)生消旋的縮合方法,，隨著可選擇性裂解的氨基酸保護(hù)基引入，該方法經(jīng)歷了一次大規(guī)模的復(fù)興,。該方法的起始原料分別是晶體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通過肼解相應(yīng)的酯很容易得到,。在-10℃的鹽酸中，用等當(dāng)量的亞硝酸鈉使酰肼發(fā)生亞硝化而轉(zhuǎn)化為疊氮化物65,依次洗滌,、干燥,，然后與相應(yīng)的氨基組分反應(yīng)。有些疊氮化物可用冰水稀釋而沉淀出來,。 二苯磷?；B氮化物(DPPA)也可以用于酰基疊氮化物的合成,。Honzl-Rudinger方法采用亞硝酸叔丁作為亞硝化試劑,，并且使疊氮縮合反應(yīng)可在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。因?；B氮化物的熱不穩(wěn)定性,，縮合反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度較高時(shí),，Curtius重排,，即?；B氮轉(zhuǎn)化為異氰酸酯的反應(yīng)成為一個(gè)主要的副反應(yīng)，最終導(dǎo)致生成副產(chǎn)物脲,。由于反應(yīng)溫度低(如4℃)而導(dǎo)致反應(yīng)速率相當(dāng)慢,，使得肽縮合反應(yīng)通常需要幾天才能*。 對于較長的N端保護(hù)的肽鏈,，酯基的肼解一般比較困難,，因此，使用正交的N保護(hù)肼衍生物是一種選擇,。在肼基的選擇性脫除后,，按倒接(backing-off)策略組合的肽片段可以用于疊氮縮合,。
如前所述,，雖然疊氮法一直被認(rèn)為是消旋化傾向最小的縮合方法，但在反應(yīng)中,，過量的堿會誘發(fā)相當(dāng)大的消旋,。因此，在縮合反應(yīng)期間要避免與堿接觸,，例如,，氨基組分的銨鹽應(yīng)采用N，N-二異丙胺或N-烷基嗎啉代替三乙胺來中和,。
雖然有上述局限性,，但該方法仍很重要，尤其對于片段縮合而言,，因?yàn)樵摲椒ň哂休^低的異構(gòu)化傾向,，適用于羥基未保護(hù)絲氨酸或蘇氨酸組分時(shí)，Nˊ保護(hù)的本行酰肼還具有多種用途,。
2.酸酐法
在多肽合成中,，最初考慮應(yīng)用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius對苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究,。從氨基乙酸銀與苯甲酰氯的反應(yīng)中,，除獲得苯甲酰氨基乙酸外，還得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6),。早期曾認(rèn)為,，當(dāng)用苯甲酰氯處理時(shí)，N-苯甲?；被峄騈-苯甲?；呐c苯甲酸形成了活性中間體不對稱酸酐。 大約在70年后,，Theodor Wieland利用這些發(fā)現(xiàn)將混合酸酐法用于現(xiàn)代多肽合成,。目前,，除該方法外，對稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內(nèi)形成的N-羧基內(nèi)酸酐(NCA,Leuchs anhydrides)也用肽縮合,。最后應(yīng)該提到,，不對稱酸酐常常參與生化反應(yīng)中的酰化反應(yīng),。
3.混合酸酐法
有機(jī)羧酸和無機(jī)酸皆可用于混合酸酐的形成,。然而，僅有幾個(gè)得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用,，多數(shù)情況下,，采用氯甲酸烷基酯。
由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐,，其氨解反應(yīng)的區(qū)域選擇性依賴依賴于兩個(gè)互相競爭的羰基的親電性和(或)空間位阻,。在由N保護(hù)的氨基酸羧酸鹽(羧基組分)和氯甲酸烷基酯(活化組分，例如源于氯甲酸烷基酯)形成混合酸酐時(shí),，親核試劑胺主要進(jìn)攻氨基酸組分的羧基,，形成預(yù)期的肽衍生物，并且釋放出游離酸形式的活性成分,。當(dāng)應(yīng)用氯甲酸烷基酯(R1=異丁基,、乙基等)時(shí)，游離的單烷基碳酸不穩(wěn)定,，立即分解為二氧化碳和相應(yīng)的醇,。然而，對于親核進(jìn)攻的區(qū)域選擇性,，也有一些相反的報(bào)道,，產(chǎn)物為氨基甲酸酯和原來的N保護(hù)氨基酸組分。 為了形成混合酸酐,，將N保護(hù)的氨基酸或肽分別溶于二氯甲烷,、四氫呋喃、二氧六環(huán),、乙腈,、乙酸乙酯或DMF中，用等當(dāng)量的三級堿(N-甲基哌啶,、N-甲基嗎啉,、N-乙基嗎啉等)處理。然后,，在-15℃--5℃,，劇烈攪拌的同時(shí)加入氯甲酸烷基酯以形成不對稱酸酐(活化)。經(jīng)短時(shí)間活化后，加入親核性氨基酸組分,。如果作為銨鹽使用(需要更多的堿),，必須避免堿的過量使用。如果嚴(yán)格按照以上的反應(yīng)條件,，混合酸酐法很容易進(jìn)行,，是*的縮合方法之一。
4.對稱酸酐法
Nα-?；被岬膶ΨQ酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體,。與混合酸酐法相反，它與胺親核試劑的反應(yīng)沒有模棱兩可的區(qū)域選擇性,。但肽縮合產(chǎn)率最高,，為50%(以羧基組分計(jì))。
雖然由對稱酸酐氨解形成的游離Nα-?；被峥梢院湍繕?biāo)肽一起,，通過飽和碳酸氫鈉溶液萃取回收，但在最初,，這種方法的實(shí)用價(jià)值極低,。對稱酸酐可以用Nα-保護(hù)氨基酸與光氣,，或方便的碳二亞胺反應(yīng)制得,。兩當(dāng)量的Nα-保護(hù)氨基酸與-當(dāng)量的碳二亞胺反應(yīng)有利于對稱酸酐的形成，對稱酸酐可以分離出來,，也可不經(jīng)純化而直接用于后面的縮合反應(yīng),。基于Nα-烷氧羰基氨基酸的對稱酸酐對水解穩(wěn)定,，可采用類似上述純化混合酸酐的方法進(jìn)行純化,。
由于Boc-保護(hù)氨基酸的商品化和合理的價(jià)格，在肽鏈的逐步延長中,，使用對稱酸酐法日益受到重視,。雖然可以買到晶狀的對稱酸酐，但原位制備仍然是一種不錯(cuò)的選擇,。
5.碳二亞胺法
碳二亞胺類化合物可用于氨基和羧基的縮合,。在該類化合物中N，Nˊ-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)相對便宜,，而且可溶于肽合成常用的溶劑,。在肽鍵形成期間，碳二亞胺轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的脲衍生物,，N,，Nˊ-二環(huán)己基脲可以從反應(yīng)液中沉淀出來。顯然，碳二亞胺活化后的活性中間體氨解和水解速率不同,，使肽合成能在含水介質(zhì)進(jìn)行,。經(jīng)幾個(gè)課題組的大量研究，確立了以碳二亞胺為縮合劑的肽縮合反應(yīng)機(jī)理,，羧酸根離子加成到質(zhì)子化的碳二亞胺,，形成高活性的O-酰基脲,；雖然還沒有分離出這個(gè)中間體,，但通過非常類似的穩(wěn)定化合物推斷了它的存在。O-?；迮c氨基組分反應(yīng),，產(chǎn)生被保護(hù)的肽和脲衍生物?；蛘?，與質(zhì)子化形式處于處于平衡狀態(tài)的O-酰基異脲,被第二個(gè)羧酸酯親核進(jìn)攻,，產(chǎn)生對稱的氨基酸酐和N,，Nˊ-二取代脲。前者與氨基酸反應(yīng)得到肽衍生物和游離氨基酸,。在堿催化下,，使用DCC的副反應(yīng)使酰基從異脲氧原子向氮原子轉(zhuǎn)移,，產(chǎn)生N-?；?1,它不再發(fā)生進(jìn)一步的氨解。不僅過量的堿可催化O-N的?；D(zhuǎn)移,，而且堿性的氨基組分或碳二亞胺也可催化該副反應(yīng)。
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