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BioRadpcr儀反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液   10ul 4種dNTP混合物   各200umol/L 引物        各10～100pmol 模板DNA       0.1～2ug Taq DNA聚合酶   2.5u Mg2+       1.5mmol/L 加雙或三蒸水至   100ul PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶,、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。
 理論上，只要知道任何一段模板DNA序列,，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
  設(shè)計引物應遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右,。
  ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
  ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。
ATGC好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
  ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補,，特別是3’端的互補,，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。
  ⑤引物3’端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗,。
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點,，這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
  ⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
  引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。
  酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應,， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。
 催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。
  dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性,。
dNTP溶液呈酸性,，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris,。
HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝， -20℃冰凍保存,。
 多次凍融會使dNTP降解,。
 在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),，就會引起錯配。
 濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。
dNTP能與Mg2+結(jié)合,，使游離的Mg2+濃度降低。
  模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。
SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸,。
 提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。
 一般臨床檢測標本,，可采用快速簡便的方法溶解細胞,，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接 用于PCR擴增,。
RNA模板提取一般采用異胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,。
  Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時,，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。
Mg2+濃度過高,，反應特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,，使反應產(chǎn)物減少,。

BioRadpcr儀 - 工作原理；
類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時  聚合酶鏈式反應間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。
 每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。