植物科學(xué)新技術(shù) 植物透明化試劑

ClearSee™

ClearSee^™ 是一種僅需固定,、洗凈、透明化三步簡單操作即可實(shí)現(xiàn)植物組織透明化的試劑,。作為植物科學(xué)的研究工具,，期待可以闡明細(xì)胞水平的現(xiàn)象和整個個體之間的系統(tǒng)聯(lián)系。

HP數(shù)據(jù)：由名古屋大學(xué)大學(xué)院理學(xué)研究科 栗原大輔特任助教,、水多陽子研究員提供

◆操作步驟

使用 ClearSee^™ 的透明化方法,，只需1）固定、2）洗凈,、3）透明化三個步驟,。詳細(xì)方法可參考隨產(chǎn)品附贈的使用說明書。

以下,，是擬南芥葉和幼株的使用案例,。

1.　固定

①　固定樣本^*1。

②　將樣本放入干燥機(jī)中,，用真空泵減壓,，在室溫下靜置30分鐘，并固定,。

②　以上操作重復(fù)兩次,。

②　為了防止植物樣品在減壓過程中飛出，建議打開管蓋,，用封口膜密封,，并用針在上面扎孔^*2,3,。

2.　洗凈

去除固定液，加入1 mL的1×PBS緩沖液,，靜置1分鐘,。然后去除1×PBS緩沖液，重新加入1 mL的1×PBS緩沖液,，靜置1分鐘,。

以上操作重復(fù)兩次。

3.　透明化處理

去除1×PBS緩沖液,，添加1.3 mL的ClearSee^™,。

打開管蓋后用封口膜密封，并用針在上面扎孔,。放入干燥機(jī)中,，用真空泵減壓,，并在室溫下靜置1小時,。

取下封口膜,，蓋好管蓋。避光,，室溫靜置,，透明化^*4。

如有需要可更換新的ClearSee^™,。

4.　透明化過程

圖4. ClearSee™中的擬南芥葉和幼株

圖5. 可以觀察到樣本周圍葉綠素（1-2天后）

圖6. 更換新的 ClearSee™ 后的樣本

圖7. 透明化的擬南芥葉和動株（3-5天后）

使用ClearSee^™ 進(jìn)行透明化需要的物品

注意

※　由于植物活體樣本含有空氣,，添加溶液時植物就會漂浮起來,。請盡可能地將植物樣本浸入固定液中。

※　請將干燥機(jī)設(shè)定在-90 kPa左右,。根據(jù)植物樣本的不同,，有時減壓會過強(qiáng)。減壓過強(qiáng)的話,，會破壞植物組織和細(xì)胞,。開始減壓后，由于會抽出植

※　物樣本中的空氣,，會產(chǎn)生氣泡。為了讓氣泡消失,，請緩慢調(diào)整減壓的壓強(qiáng),。

※　從減壓狀態(tài)恢復(fù)至大氣壓強(qiáng)時,，請緩慢進(jìn)行,。如果急速恢復(fù)至大氣壓強(qiáng)的話,，會破壞植物組織和細(xì)胞。

※　透明化的時間根據(jù)植物種類和組織而異,，請參照以下的時間。

※　根：1~2天,、葉和幼株：4~7天、雌蕊：2周,、成熟組織：4周。

◆觀察案例

5.　觀察

在載玻片上用凡士林或油脂制作一個圍欄,，放入適量 ClearSee^™,，用鑷子將樣本移入，蓋好蓋玻片,，并用熒光顯微鏡觀察。由于 ClearSee^™干燥后會產(chǎn)生沉淀,，所以用凡士林或油脂來防止其干燥。觀察結(jié)束后,，可以將植物樣本放回裝有 ClearSee^™ 的微管中進(jìn)行保存。

另外,，用 ClearSee^™ 透明化的樣本亦可用熒光色素進(jìn)行染色,。細(xì)胞核染色時，向 ClearSee^™ 中添加終濃度為 10 μg/ mL 的雙苯甲酰亞胺 H33258 三鹽酸鹽,，雙苯甲亞胺 H33342 或 DAPI,，細(xì)胞壁染色時，使用終濃度為 1 mg/mL,，靜置１小時后，更換新的 ClearSee^™ ,，再靜置１小時后,，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,。

圖8. 經(jīng)透明化處理的擬南芥葉在明場中呈透明狀態(tài),，葉綠素的紅色自發(fā)熒光消失。

圖8. 　由于可以對整片葉進(jìn)行觀察,，因此也可以觀察到維管束內(nèi)的熒光蛋白,。比例尺為 200 μm。

圖9. 使用 ClearSee^™ 透明化的完整的雌蕊的熒光觀察,。

圖2.　用４個顏色（藍(lán)色，綠色,，黃色,，紅色）的熒光蛋白標(biāo)記花粉管,。

圖2.　根據(jù)參考文獻(xiàn)改編轉(zhuǎn)載,。

圖10. 使用 ClearSee^™ 處理４天的擬南芥的根,。

圖10.　生長素應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞核用綠色、全身的細(xì)胞核用紫色顯示,。

圖10.　根據(jù)參考文獻(xiàn)改編轉(zhuǎn)載,。

■其他植物的透明化案例

使用 ClearSee^™ 透明化６天后的藍(lán)豬耳、矮牽牛,、煙草,、番茄,、黃瓜、稻葉,。

稻葉在透明化時,，由于葉子的表面有蠟層，因此很難將溶液滲入組織里,，通過在氯仿等有機(jī)溶劑中浸泡 10~30 秒除蠟后，開始固定的步驟,。

圖11. 使用 ClearSee^™ 透明化的各種植物葉片（６天后）

◆參考文獻(xiàn)

Kurihara, D. et al.: Development, 142, 4168-4179 （2015）.

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