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SNP Pol DNA 聚合酶用于簡單,、可靠和快速的等位基因特異性區(qū)分,，例如。CRISPR / Cas9 點(diǎn)突變,，用于檢測(cè)不正確的 CRISPR / Cas9 產(chǎn)物,，或驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。SNP Pol DNA 聚合酶可區(qū)分高度特異性,，無論是否存在引物-模板-復(fù)合物的不匹配,。錯(cuò)配（點(diǎn)突變）必須在引物的 3 ' 端。因此,，突變等位基因可以與野生型等位基因精確區(qū)分 - 無需測(cè)序,，因?yàn)榫酆厦冈阱e(cuò)配的情況下根本不擴(kuò)增。

只需將引物放在假定的點(diǎn)突變上（重要提示：點(diǎn)突變必須在 3 '端），聚合酶就會(huì)以幾乎 100% 的準(zhǔn)確率檢測(cè)到該區(qū)域的錯(cuò)配：如果與引物的 3' 端互補(bǔ)的模板堿基顯示突變,，而引物沒有,，則不會(huì)發(fā)生擴(kuò)增 - 在短時(shí)間內(nèi) 100% 確定！
因此,，SNP Pol DNA 聚合酶可以輕松,、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)高效地用于篩選點(diǎn)突變。

變體 SNP PolTaq DNA 聚合酶 > 具有 5'-3'核酸酶活性,，因此可用于特異性水解探針,，如 Taqman® 探針或分子信標(biāo)。

描述

SNP Pol DNA 聚合酶是一種高選擇性 DNA 聚合酶,，用于檢測(cè) S單核苷酸 P卵形性,。它是專門為等位基因特異性鑒別而開發(fā)的，其中需要非常高的鑒別率,，例如,，在等位基因特異性 PCR （ASA;AS-PCR）、等位基因特異性引物延伸 （AS-PEX）,、SNP 分析,、基因分型或甲基化特異性 PCR （MSP）。許多其他 DNA 聚合酶可耐受錯(cuò)配的引物-模板復(fù)合物,，因此不適合,。另一方面，SNP Pol DNA 聚合酶可以特異性地區(qū)分這些（高鑒別性）,，并且只提供具有匹配引物對(duì)的 PCR 產(chǎn)物,！Genaxxon SNP Pol 和 SNP PolTaq DNA 聚合酶通過兩個(gè)等位基因之間的等位基因特異性 PCR 相差高達(dá) 100%，并且在簡單的 qPCR 之后,，給出了存在哪個(gè)等位基因的明確結(jié)果,。因此，CRISPR/Cas9 技術(shù)的巨大潛力可用于人類醫(yī)學(xué)和植物生物技術(shù),，尤其是與 SNP PolTaq 或 SNP Pol DNA 聚合酶一起使用,。

等位基因特異性 PCR 可用于量化野生型序列池或背景中的突變率。NGS 確定的突變頻率的驗(yàn)證也可以通過等位基因特異性 PCR 和 SNP Pol DNA 聚合酶進(jìn)行驗(yàn)證,。SNP PolTaq DNA 聚合酶非常適合液體活檢樣品的分析,。使用 SNP PolTaq，可以很好地分析和量化癌癥突變的存在和頻率,。

下圖：應(yīng)用資料 SNP Pol DNA 聚合酶

我們建議使用較短的擴(kuò)增子長度（約 60-200 bp）以獲得最佳結(jié)果,，但也建議使用較長的擴(kuò)增子長度。如果擴(kuò)增子較長 >500 bp）,，則可能需要添加額外的鎂 （+0.5 - 1.5 mM）,。

故障排除：
PCR 30 個(gè)循環(huán)后沒有條帶,！
缺失或弱條帶的優(yōu)化程序。

退火溫度過低,！

注意力： SNP Pol 是一種適配體抑制的 DNA 聚合酶,。使用的適配體寡核苷酸在 <55°C 的溫度下可逆地抑制聚合酶！因此,，引物的理想退火溫度應(yīng)為 >57°C,。

- real-time PCR 方法
- 檢查 dNTP 濃度。這應(yīng)該在 200 到 300 μM 之間（在 PCR 中）,。
- 增加循環(huán)次數(shù)（至少 35 次,，最好等于 40 次）

測(cè)試優(yōu)化 - 循環(huán)
次數(shù) 在終點(diǎn)檢測(cè)中，30 個(gè)循環(huán)計(jì)數(shù)并不總是足以生成清晰可見的波段,。例如,，以少于 200 個(gè) DNA 拷貝為起始值。因此,，應(yīng)使用實(shí)時(shí) PCR 進(jìn)行檢測(cè),，或者應(yīng)使用五個(gè)平行 PCR，其中一個(gè)在五個(gè)不同循環(huán)后從 PCR 設(shè)備中取出（示例如下）,。

終點(diǎn)檢測(cè)：
使用 SNP Pol DNA 聚合酶平行構(gòu)建 5 個(gè)相同的 PCR 反應(yīng),。 在 20、25,、30、35 和 40 個(gè)循環(huán)中分別從循環(huán)儀中取出一個(gè) PCR 管,，并在最后將所有五個(gè)反應(yīng)應(yīng)用于瓊脂糖凝膠,。 這使得很容易識(shí)別 PCR 中給定應(yīng)用（起始材料、靶標(biāo),、引物）的最佳循環(huán)數(shù),。

含細(xì)胞裂解物
的 SNP Pol PCR 動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌可直接用于 SNP Pol DNA 聚合酶的 PCR！無需單獨(dú)裂解或蛋白酶 K 消化,。

PCR 程序：

1. 每個(gè) PCR 批次需要 50 - 500 個(gè)細(xì)胞,！
2. 制備帶有引物和緩沖液的 PCR 混合物，并置于冰上,！
3. 將挑選的菌落直接加入 10-20 μL 水中（無需單獨(dú)裂解,，無需蛋白酶 K 消化）， 短暫渦旋（5 秒）,，然后將該細(xì)胞懸液直接添加到 PCR 反應(yīng)混合物中,，例如 10 μL 細(xì)胞懸液，用于 PCR 制備,，總體積為 20 μL,。2-3 分鐘的初始變性時(shí)間就足夠了 足夠,，必要時(shí)可延長至 5 分鐘。
每個(gè)反應(yīng)最多 100 個(gè)拷貝的基因組 DNA 相對(duì)較低,，但應(yīng)該仍然有效,。 該細(xì)胞懸液的其余部分也可以冷凍掉，以便進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試,。

可選：
4,。如果可能：進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR！

SNP Pol DNA 聚合酶（M3009 > 或 M3061 >）可與非特異性熒光染料（例如 Genaxxon 的 Green DNA 染料 > 或 SybrGreen®）一起用于實(shí)時(shí) PCR,。當(dāng)使用特異性 PCR 探針時(shí),，只能使用 SNP PolTaq DNA 聚合酶，因?yàn)橹挥羞@些探針具有 5'-3'核酸外切酶活性,。

使用我們的高質(zhì)量 dNTP（> Set （M3015.4100） 或混合 （M3016.1010） > 或我們的 DNALadders > 和我們有利的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖 （M3044） >我們可以為您的 PCR 提供額外的產(chǎn)品,。

SNP Pol DNA 和 SNP Pol DNA 聚合酶
的應(yīng)用領(lǐng)域 - 點(diǎn)突變的監(jiān)測(cè)、驗(yàn)證和檢測(cè)
- 鑒定正確或錯(cuò)誤的 CRISPR/Cas9 產(chǎn)品
- 測(cè)序結(jié)果
的驗(yàn)證/確認(rèn) - 突變的定量（例如 NGS 結(jié)果）
- 通過等位基因特異性擴(kuò)增 （ASA） / 等位基因特異性 PCR
進(jìn)行 SNP 檢測(cè)- 亞硫酸氫鹽處理 DNA 后的甲基化特異性 PCR （MSP）（CpG 甲基化側(cè)）
- HLA 基因分型
- 微測(cè)序
- 使用水解探針進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR
- 實(shí)時(shí)多重 PCR