熒光壽命的測定

吸收光后,，分子在釋放吸收的能量之前保持一定時間的電子激發(fā)態(tài),。在這里，不同的光化學過程以不同的概率相互競爭,。除了無輻射失活外,，還可以發(fā)射光，例如以熒光的形式,。
之后激發(fā)分子數(shù)（n1）已降至1/e的系數(shù)（約37%）,，稱為熒光壽命（τ佛羅里達州):

n1（t） = n1（0） e（- t / τ佛羅里達州)

有機染料的衰減行為可以用來識別它。然而,，熒光壽命(熒光衰減時間)不是一個固定的量,，而是受染料所處環(huán)境即溶劑和溫度的影響。

ATTO染料 的熒光壽命通常在納秒范圍內(nèi)（10 -9秒）,。對于我們的目錄,，使用下述“時間相關(guān)單光子計數(shù)"方法確定 22 °C 水溶液（PBS，pH 7.4）中羧基衍生物的值,。為此使用了來自HORIBA Jobin Yvon的使用壽命測量設(shè)備TemPro ,。


時間相關(guān)單光子計數(shù) （TCSPC）
激發(fā)后熒光光子的發(fā)射是一個統(tǒng)計過程。因此,，單個分子保持激發(fā)態(tài)的持續(xù)時間也是一個統(tǒng)計量。然而,，如果我們觀察許多相同分子的集合,，我們會得到一個定義明確的衰變統(tǒng)計量。
在當今常用的熒光壽命測量方法TCSPC方法中,，這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)的時間分辨非常好 - 低至皮秒范圍（10-12 s） – 并以高檢測靈敏度進行測量,。為此，用周期性的極短光脈沖照射樣品。激發(fā)后,，樣品發(fā)射熒光光子,。測量第一個光子到達探測器之前的確切時間量。這些單個事件被計數(shù),，即作為“計數(shù)"輸入直方圖,。隨著這種單個實驗的非常頻繁的重復，最終通過加計數(shù)來獲得樣品衰變曲線的指數(shù)過程,。

在每個激光脈沖和計數(shù)過程之后,，必須重置測量電子設(shè)備。在此死區(qū)時間內(nèi)無法記錄任何光子,。因此,，以每 100 個激發(fā)脈沖僅檢測到約 1 個光子的方式選擇條件。否則,，在較高的速率下,，直方圖中的短時間會被高估并且衰減曲線會扭曲（“堆積"）。實際上,，測量通常以所謂的“時間反轉(zhuǎn)"模式進行,，即熒光光子開始時間測量，而由另一個二極管記錄的激光脈沖停止時間測量,。

在測量染料樣品之前,，應提供有關(guān)染料的以下信息：

• 吸收和熒光最大值，例如來自溶液或文獻值的吸收和熒光光譜的測量,。

• 熒光衰減時間的近似數(shù)量級,，例如根據(jù)以前的測量、可比系統(tǒng)的測量或文獻值估計,。

光譜數(shù)據(jù)決定了激發(fā)光源的選擇——如今通常使用強激光或半導體二極管——以及用于發(fā)射光譜選擇的截止濾光片的選擇,。應選擇此濾光片以防止散射的激發(fā)光到達檢測器。

除了選擇合適的激發(fā)光源和合適的邊緣濾光片外,，還必須遵守其他實驗要求：

• 樣品溶液在激發(fā)波長及以上的1cm比色皿中的吸光度應<0.1,，以避免重吸收。例如,，稀釋溶液還可以防止由聚集和濃度缺失引起的問題,。

• 散射樣品溶液會導致評估期間意外縮短壽命的“出現(xiàn)"。例如,，可以通過μ過濾樣品溶液來避免這種情況,。

• 通常，透明液體在 1 厘米熒光比色皿中以 90° 排列的方式測量,。

• 檢測時間窗口應足夠長（至少 10000 個計數(shù)）,。

在根據(jù)TCSPC原理進行熒光壽命測量的情況下，還需要確保計數(shù)率不超過脈沖激發(fā)光源重復率的2%。如上所述,，這避免了所謂的“堆積",。

為了降低計數(shù)率，

• 稀釋供試品溶液,。

• 中性玻璃濾光片可以插入激發(fā)通道,，從而降低激發(fā)光的強度。

• 可以將波長較長的邊緣濾光片插入發(fā)射通道,，從而減小檢測到的熒光的光譜范圍,。

要將計數(shù)率提高到 2%，可以應用反向度量,。

在測量熒光衰減時間時,，還應測量散射溶液.dem例如0.01%Ludox AS40膠體二氧化硅溶液，以確定儀器功能,，即電子器件的響應,。這種參考測量的結(jié)果可以在以后的數(shù)據(jù)評估中考慮在內(nèi)。

通過提供的軟件進行數(shù)據(jù)分析,。在這里,，測量的數(shù)據(jù)點由曲線擬合。熒光衰變曲線的理論過程與放射性衰變一樣,，對應于一階反應,，因此是單指數(shù)的。但是,，它也可能導致更高的指數(shù)曲線,，以便更好地擬合測量點。例如,，在一個溶液中存在具有不同熒光壽命的不同物種時,，可能就是這種情況。

下圖說明了一批 阿托 488 卡波西與 天寶裝置,?？梢宰R別上述參數(shù)，例如檢測時間窗口（峰計數(shù)>10000）,，使用Ludox溶液的參考測量/提示以及樣品的測量,。CHISQ = 1.1 且標準差均勻分布的雙指數(shù)評估結(jié)果證明是最佳擬合的。熒光衰減時間 阿托 488 22 °C 水溶液 （PBS,， pH 7.4） 中的羧基為 4.1 ns,，該樣品中的相對比例為 96.78 %。



軟件中選擇的補償曲線的質(zhì)量以及確定的熒光壽命的正確性等由參數(shù)χ2 （CHISQ,，XSQ）和加權(quán)殘差。
良好的契合度可以通過以下方式識別：

• χ 2 < 1.2 并且在添加另一個組件時沒有顯著變化（單指數(shù) -> 雙指數(shù)等）

• 加權(quán)殘差的均勻分布，標準差

• 與以前的測量值或文獻值一致

商業(yè)設(shè)備的供應商提供大量的手冊和產(chǎn)品文檔,，通常詳細描述相關(guān)設(shè)備的正確操作和所提供的軟件,。通過遵守給出的說明，例如,，測量具有已知熒光衰減時間的染料,，您將擁有必要的常規(guī)和經(jīng)驗來測量所用設(shè)備的“正確"壽命