光的吸收
除了在部分或透明的物質(zhì)上發(fā)生折射、散射,、干涉和衍射現(xiàn)象外,，還可以產(chǎn)生一種顏色印象，如彩虹、蔚藍(lán)的天空,、閃閃發(fā)光的肥皂泡,、華麗的孔雀羽毛或薄薄的油膜和層，顏色主要通過(guò)光的吸收或反射出現(xiàn)在我們的環(huán)境中,。
物質(zhì)的“色彩"是通過(guò)選擇性吸收來(lái)自電磁輻射光譜的可見(jiàn)部分的光而產(chǎn)生的,。這個(gè)范圍介于紫外線和紅外光之間。在分子水平上,，這意味著分子進(jìn)入電子激發(fā)態(tài)：通過(guò)吸收光量子（光子）,，電子從占據(jù)的最高分子軌道上移走（HOMO = h最遠(yuǎn) o被占用 m耳目 o比妥;能源 E1）進(jìn)入最di的未占用分子軌道（LUMO= l奧韋斯特 u已占用 m耳目 o比妥;能源 E2）已提出。
E光子= h ? υ = (h ? c) / λ = ΔE = E 2 - E 1
E光子：光子的能量
h：普朗克常數(shù)
υ：輻射頻率
c：光速
λ：輻射波長(zhǎng)
ΔE：兩個(gè)能級(jí)之間的能量差
被吸收的光子的能量正好對(duì)應(yīng)于兩個(gè)能級(jí)的能量差,，即分子只能以離散的能量狀態(tài)存在,，能量被“量子化"，只能以規(guī)定的部分被吸收或釋放,。
紫外/可見(jiàn)光譜
可以測(cè)量光的吸收 - 例如在染料溶液中 - 可以測(cè)量,。定量紫外/可見(jiàn)光譜的基礎(chǔ)是朗伯-比爾定律：
E = lg（I0 / I） = ε ?c ? d
E：吸光度
ε：摩爾消光系數(shù)
c：濃度
d：層厚
我0：樣品前的光強(qiáng)度
I：樣品后的光強(qiáng)度
通過(guò)變換方程，得到化合物的濃度c,。
c = E / （ε ? d）
蘭伯特-比爾定律適用于單色輻射,。通過(guò)繪制波長(zhǎng)上的吸光度，可以獲得不同波長(zhǎng)的化合物的紫外/可見(jiàn)光譜,。
朗伯-比爾定律對(duì)于高濃度溶液以及濃度依賴性反應(yīng)的發(fā)生（例如 染料的聚集 代表,。
當(dāng)穿過(guò)溶液時(shí)，光束變?nèi)?，部分光已被溶液中的分子吸收,，即忽略散射和反射?
A + T = 1 = (I0 – I)/ I0 + I/ I0
A = 吸收 = 光的吸收部分 = (I 0 – I) / I 0
T = 透射 = 光的透射部分 = I / I 0
因此適用以下內(nèi)容：
E = -lg (T)
Lambert-Beer 定律中的比例常數(shù)是與波長(zhǎng)相關(guān)的材料常數(shù)，并且描述了允許激發(fā)的所謂躍遷概率,。適用光譜選擇規(guī)則,，即區(qū)分允許和禁止的躍遷。最重要的選擇規(guī)則是保持多重性（見(jiàn)下文）,。允許的躍遷具有更高的躍遷概率,，因此具有更高的消光系數(shù)。對(duì)于有機(jī)染料,，長(zhǎng)波吸收最大值處的消光系數(shù)值 > 10 5 L mol -1 cm -1,；這些是共軛 π 系統(tǒng)中允許的躍遷,。
吸收是一個(gè)非?？焖俚倪^(guò)程（10 -15到 10 -14秒），不會(huì)發(fā)生自旋反轉(zhuǎn),。分子通過(guò)吸收光子吸收的能量在激發(fā)態(tài)的有限壽命后以不同形式再次釋放,。如果排除光化學(xué)反應(yīng)，則除了以熱能形式發(fā)射之外，還可能發(fā)生熒光或磷光等發(fā)光現(xiàn)象,。這些基本的光物理過(guò)程,，其中分子的化學(xué)特性保留在最后，可以用 Jablonski 圖或 Jablonski 項(xiàng)圖的形式圖形表示,。
其中緊挨著電子能級(jí) S 0 – S 2和 T 1還顯示了相關(guān)的振動(dòng)子級(jí)別,。輻射過(guò)程（波浪線）和非輻射過(guò)程（線）之間的表示有所區(qū)別。
單線態(tài)S只有成對(duì)電子,，總自旋為S = 0,；三重態(tài) T 有兩個(gè)不成對(duì)的電子，總自旋為 S = 1,；這給出了多重性 M = 2 S + 1（存在磁場(chǎng)時(shí)的能級(jí)數(shù)）,。 M = 1 for singlet states and M = 3 for triplet states. 因此，多重性守恒的選擇規(guī)則僅允許單線態(tài)或三線態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)換（“自旋禁止"）,。
熒光
熒光（10 -9至 10 -7s) 表示通過(guò)從第一激發(fā)單重態(tài) S 1的振動(dòng)能級(jí)躍遷到 電子基態(tài) S 0的振動(dòng)能級(jí) （即在等多重態(tài)之間）使受激分子失活時(shí)可觀察到的光發(fā)射（“Kasha 規(guī)則"）,。因此，觀察到的熒光與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān),。
GG Stokes 在發(fā)光礦物螢石 (CaF 2) 如此命名,，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)與有機(jī)分子的某些結(jié)構(gòu)特征相關(guān)：非芳烴不顯示任何熒光；即使它們有 11 個(gè)共軛雙鍵,，如番茄紅素,，也不會(huì)，而芳香族化合物幾乎能夠發(fā)出熒光,。
因此,，在許多（如果不是全部）情況下，剛性和平面分子結(jié)構(gòu)（通常是“芳烴"的情況）可能被視為良好熒光能力的先決條件,。
此外,，已經(jīng)表明，將某些基團(tuán)引入芳烴會(huì)削弱熒光,。其中包括硝基,，這意味著例如硝基苯不會(huì)發(fā)出熒光。
組合 (ISC)
然而,，溴或碘原子也會(huì)降低熒光,。然后人們談到了內(nèi)部重原子效應(yīng)。這些取代基通過(guò)更大的自旋軌道耦合促進(jìn)了實(shí)際上自旋禁止的轉(zhuǎn)變?yōu)槿€態(tài)系統(tǒng),。單重態(tài)系統(tǒng)和三重態(tài)系統(tǒng)的等能振動(dòng)能級(jí)之間的這種相互轉(zhuǎn)變被稱為“系統(tǒng)間交叉" ( ISC) ,。具有不成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)，例如分子氧 O 2,，也充當(dāng)介導(dǎo)這種轉(zhuǎn)變的催化劑,。 三重態(tài) T 1的振動(dòng)基態(tài)失活中的磷光A
在電子基態(tài)S 0的振動(dòng)能級(jí)發(fā)生的光發(fā)射 稱為磷光,。與只有在激發(fā)時(shí)才能觀察到的熒光不同，磷光也可以在激發(fā)結(jié)束后發(fā)生或持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間（“余輝"）,。這又與自旋禁令有關(guān),，導(dǎo)致三線態(tài)的壽命更長(zhǎng)（10 -4到 10 2秒），從而延遲到單線態(tài)基態(tài)的失活,。
斯托克斯位移
由于熒光或磷光總是來(lái)自電子激發(fā)態(tài) S 1或 T的振動(dòng)基態(tài) v 01發(fā)生時(shí),，與激發(fā)帶相比，發(fā)射帶總是移動(dòng)到更高的波長(zhǎng),，即紅移,。與熒光相比，磷光移動(dòng)到更長(zhǎng)的波長(zhǎng),。
內(nèi)部轉(zhuǎn)換 (IC)此外,，可以發(fā)生稱為
“內(nèi)部轉(zhuǎn)換"(IC) 的失活，例如,，通過(guò)從第一電子激發(fā)態(tài) S 1的振動(dòng)基態(tài) 到電子基態(tài) S 0的等能電子振動(dòng)能級(jí)的轉(zhuǎn)變 .然后從這種較高的激發(fā)振動(dòng)水平（10 -12s) 放出熱量,。這種類型的無(wú)輻射失活總是比發(fā)光過(guò)程更快。這個(gè)過(guò)程似乎對(duì)流動(dòng)性很強(qiáng)的分子特別有效,。因此,，在脂肪族化合物的情況下，人們發(fā)現(xiàn)幾乎是內(nèi)部轉(zhuǎn)變到電子基態(tài)并且沒(méi)有熒光,。在大多數(shù)其他分子中,，非輻射失活過(guò)程也支配著發(fā)光過(guò)程。
熒光染料
只有極少數(shù)有機(jī)染料的非輻射失活速度足夠慢,，足以保證激發(fā)態(tài)到基態(tài)的轉(zhuǎn)變,，在這種轉(zhuǎn)變中，多余的能量通過(guò)光子的發(fā)射以熒光的形式釋放出來(lái),。
熒光染料的特征在于其光譜特性,，例如激發(fā)和發(fā)射光譜、熒光量子產(chǎn)率 (η fl ) 和熒光衰減時(shí)間 (τ fl ),。染料的熒光與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān),。
選擇染料作為熒光標(biāo)記時(shí)需要考慮的事項(xiàng)在相應(yīng)部分中顯示。
光譜特性
熒光染料的光譜特性在很大程度上取決于分子結(jié)構(gòu),。為了使分子的吸收在可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍 (400 - 700 nm) 內(nèi),，基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能量差必須足夠低。有機(jī)染料最顯著的結(jié)構(gòu)特征是共軛π電子系統(tǒng),，即所謂的“發(fā)色團(tuán)"（希臘色載體）,。
在大多數(shù)情況下，染料的熒光光譜在一級(jí)近似下是最長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收帶的鏡像,，熒光通常移動(dòng) 25 - 40 nm 到更長(zhǎng)的波段,。
吸收羅丹明染料
最ATTO-染料，發(fā)色團(tuán)具有剛性分子骨架,。許多代表屬于羅丹明染料家族,。這些染料的共同結(jié)構(gòu)元素是呫噸骨架中心碳原子上的羧基苯基取代基。
羧基（紅色）位于 2 位或鄰位,，顯著影響所有羅丹明的物理化學(xué)性質(zhì),。例如
，由于存在游離的鄰位羧基,，ATTO 565和ATTO 590及其衍生物具有在處理這兩種染料時(shí)必須考慮的特殊性質(zhì),。用作熒光標(biāo)記的有ATTO 565和ATTO 590苯基取代基的 4 位或 5 位上的額外羧基：
吸收波長(zhǎng)對(duì) pH 值的依賴性
鄰位羧基的質(zhì)子化-去質(zhì)子化平衡影響羅丹明的光學(xué)性質(zhì)發(fā)色團(tuán)強(qiáng)。染料ATTO 565和ATTO 590
的吸收最大值位置對(duì)于染料的質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式是不同的,。例如,，相對(duì)于質(zhì)子化形式，通過(guò)兩個(gè)羧基的去質(zhì)子化（添加三乙胺）,，乙醇中ATTO 565的吸收最大值移動(dòng)16 nm 至更短的波（亞光）：
染料-螺內(nèi)酯平衡在平衡狀態(tài)下,， ATTO 565和ATTO 590
也 可以形成去質(zhì)子形式的無(wú)色螺內(nèi)酯：在羧酸根陰離子對(duì)中心碳進(jìn)行親核攻擊的過(guò)程中形成五元環(huán)，染料的發(fā)色系統(tǒng)被打斷, 因此形成的化合物不再被可見(jiàn)光吸收并發(fā)出熒光： 螺內(nèi)酯的比例或這種平衡的位置在很大程度上取決于溶劑,、pH 值,、溫度和染料結(jié)構(gòu)。在極性非質(zhì)子溶劑中,，平衡幾乎位于螺內(nèi)酯一側(cè),；在無(wú)水丙酮中是ATTO 565染料的溶液
因此，ATTO 590幾乎是無(wú)色的,。另一方面,，在水或乙醇等極性質(zhì)子溶劑中，平衡——如上所述——幾乎在有色形式的一側(cè),。
熒光光譜在大多數(shù)情況下,，染料的熒光光譜是長(zhǎng)波吸收帶的鏡像，這里以ATTO 514
為例可以很好地看出： 熒光最大值通常偏移 25 - 40 nm與吸收最大值相比更長(zhǎng)的波,。這種所謂的斯托克斯位移
進(jìn)一步受到激發(fā)態(tài)壽命期間染料周圍溶劑分子重新定向的影響,，因此發(fā)射發(fā)生在較低能量的“溶劑松弛態(tài)"。激發(fā)期間電子分布變化越大,，能量差就越大,，因此斯托克斯位移就越大。這在我們的ATTO LS 染料中得到了實(shí)際應(yīng)用,。
熒光量子產(chǎn)率 (η fl )
熒光染料最重要的特性之一是熒光量子產(chǎn)率 (η fl ),。量子產(chǎn)率描述了發(fā)射光子的比率 (n fl) 到吸收的光子數(shù) (n abs )。
η fl = n fl / n abs
因此,，熒光量子產(chǎn)率永遠(yuǎn)不會(huì)超過(guò) 100%,。如上所述,，非輻射失活過(guò)程經(jīng)常與熒光競(jìng)爭(zhēng)，從而降低量子產(chǎn)率,。
高熒光量子產(chǎn)率對(duì)于通過(guò)熒光研究染料當(dāng)然是有利和可取的,。我們將在別處更詳細(xì)地探討熒光量子產(chǎn)率
的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。熒光衰減時(shí)間 (τ fl )
激發(fā)后熒光光子的發(fā)射是一個(gè)統(tǒng)計(jì)過(guò)程,。因此,，單個(gè)分子保持在激發(fā)態(tài)的時(shí)間也是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量。然而,，如果考慮許多相同分子的集合,，則會(huì)產(chǎn)生明確定義的衰變統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在通過(guò)短激光脈沖激發(fā)后,，分子數(shù)量在簡(jiǎn)單的情況下呈指數(shù)下降,。激發(fā)分子的數(shù)量 (n 1 ) 下降到 1/e 系數(shù)（約 37%）之后的時(shí)間稱為熒光衰減時(shí)間 (τ fl )。
n 1 (t) = n 1 (0) exp(- t / τ fl )
熒光衰減時(shí)間是染料的重要特性,，可用于識(shí)別染料,。我們的ATTO染料的 τ fl值通常在納秒范圍內(nèi)。熒光衰減時(shí)間 的確定在別處描述,。分子相互作用 熒光衰減時(shí)間與染料的熒光量子產(chǎn)率一樣,，不是一個(gè)固定的量，而是受染料所處環(huán)境（即溶劑和溫度）的影響,。染料的衰減時(shí)間和量子產(chǎn)率不是彼此獨(dú)立的,，而是通過(guò)以下關(guān)系相互關(guān)聯(lián)的： τ fl
= τ 0 × η fl
τ 0是在沒(méi)有無(wú)輻射失活的情況下發(fā)生的所謂自然衰減時(shí)間(η fl
= 100%)。 因此,，熒光衰減時(shí)間的變化可以提供有關(guān)染料分子局部環(huán)境變化的信息,。
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