鈷瓊脂糖凝膠 Co BerpharoseFF His tag組氨酸標(biāo)簽蛋白純化柱
鈷-瓊脂糖凝膠FF（NTA）
（Co-Berpharose FF-NTA）
1. 產(chǎn)品介紹
鈷-瓊脂糖凝膠FF（NTA）以瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì),，活化偶聯(lián)次氮基三乙酸（NTA）,，之后螯合Co2+。鈷 NTA 瓊脂糖凝膠 FF 具特異性好,，螯合鈷更穩(wěn)定,，不易脫落，能耐受更高的還原劑，物理和化學(xué)穩(wěn)定性好,。
鈷-瓊脂糖凝膠FF主要用于純化含有組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）的重組蛋白,。組氨酸標(biāo)簽中的咪唑環(huán)同過渡金屬Ni2+形成穩(wěn)定的配位鍵，能特異,、牢固和可逆地吸附在固定有Co2+的基質(zhì)上,，可通過增加咪唑濃度對重組蛋白進(jìn)行競爭洗脫。

2.規(guī)格
1ml（預(yù)裝柱）,、5ml（預(yù)裝柱）,、10ml（預(yù)裝柱）、20ml,、100ml,、500ml
（3）常用緩沖液有10-100 mM磷酸鈉緩沖液、20-200 mM Tris-HCl緩沖液等,。
（4）緩沖液中一般要加入0.15-0.5 M的NaCl以消除離子交換作用,。
（5）初次使用鈷-瓊脂糖凝膠FF時(shí)，推薦使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4,、0.5 M NaCl,、pH 7.4）作為初始緩沖液。
③洗脫
（1）增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是鈷-瓊脂糖凝膠FF最常用的洗脫方法,。
（2）咪唑?yàn)閴A性,，相應(yīng)緩沖液配制后需要用HCl調(diào)節(jié)pH值。
（3）初次使用鈷-瓊脂糖凝膠FF時(shí),，如不確定洗脫需要的咪唑濃度,，推薦在初始緩沖液中分別加入10 mM、20 mM,、50 mM,、100 mM、200 mM,、500 mM咪唑,，濃度從低
到高分別洗脫和收集重組蛋白，之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果,。
（4）有條件的可以進(jìn)行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件,。

洗脫方法：
（1）降低pH洗脫：大多數(shù)蛋白在pH4-6會被洗脫下來（也可以在pH 3~4），緩沖液可以是醋狻鈉,、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。
（2）競爭性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質(zhì)的濃度（如0-0.5M咪唑,、0-50 mM組氨酸,、0-2M NH4Cl）。梯度洗脫最好在起始緩沖液的恒定pH值下進(jìn)行。
（3）螯合劑洗脫：EDTA,、EGTA等螯合劑可同金屬離子產(chǎn)生作用力,，導(dǎo)致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白,，還會影響蛋白的吸附,，導(dǎo)致融合蛋白無法掛柱。
注：降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使得金屬離子脫落,，下次使用前需要重新螯和金屬離子,。最常用的方法為競爭性洗脫。
上述洗脫方法,，均須在緩沖液中加入150 -500mM的NaCl以消除離子交換作用,。
5.再生、清洗,、保存
①凝膠再生
（1）多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時(shí),，必須將凝膠脫鈷再生。脫鈷方法：用5-10個(gè)柱體積的蒸餾水淋洗柱子,，再用5-10個(gè)柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子,，最后用2-3個(gè)柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。
（2）多次使用的柱子脫鈷后一般需要進(jìn)行清洗,。清洗方法：用0.1-1.0 M NaOH反向清洗柱子,，50 cm/h保持1-2 h，能去除結(jié)合強(qiáng)的雜質(zhì),，同時(shí)也能去除熱源,。
（3）清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法：用2-5個(gè)柱體積的蒸餾水充分平衡脫鈷后的柱子,，用0.1-0.3 M金屬鹽溶液過柱5-10個(gè)柱體積以螯合金屬離子,，之后用5-10個(gè)柱體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。
②在位清洗
（1）去除因離子交換作用吸附的蛋白：使用1.5M NaCl 溶液接觸時(shí)間為10-15 分鐘清洗,，然后,，再使用去離子水清洗10 個(gè)柱體積。
（2）去除強(qiáng)疏水性蛋白和脂質(zhì)等：通過使用30%異丙純清洗5-10 個(gè)柱體積,，接觸時(shí)間為15-20 分鐘可以去除此類污染物,。然后，再使用10 倍柱體積的去離子水清洗,。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液,， 清洗填料2 倍柱體積。例如,，含有0.1–0.5% 非離子去污劑的0.1 M 醋狻溶液,，接觸時(shí)間 為1–2 小時(shí),。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗5 個(gè)柱體積,，以徹底去除去污劑,。 最后使用10 倍柱體積的去離子水清洗。
（3）除去蛋白沉淀,、疏水性蛋白：參照凝膠再生步驟,。

6.注意事項(xiàng)：
1）使用時(shí)保證柱子和緩沖液的溫度一致，避免柱床內(nèi)產(chǎn)生氣泡,，影響純化效果,。
2）本產(chǎn)品保存條件為20%乙醇，4-8℃,。
3） 2-25℃,常壓,避光運(yùn)輸
4）僅供科研實(shí)驗(yàn)使用
鈷瓊脂糖凝膠 Co BerpharoseFF His tag組氨酸標(biāo)簽蛋白純化柱