一,、背景過高

原因：

封閉不充分,；一抗過濃；孵育溫度過高,；一抗二抗封閉劑間有交叉反應,；洗膜不充分；膜過于干燥

方案：

延長封閉時間或更換封劑,；稀釋一抗,；4℃孵育；加入Tween-20,，以減少交叉反應,；設二抗對照，稀釋二抗,；增加洗膜次數(shù),；避免干膜

二、無條帶或太弱

原因：

一抗二抗選擇錯誤,；一抗二抗?jié)舛冗^低,；一抗失效；蛋白含量過低,；轉(zhuǎn)膜不充分或洗膜過度,；過度封閉；二抗受疊氛鈉抑制,；底物與酶失效,；曝光時間過短

方案：

選擇正確抗體；檢查抗體和顯色試劑盒保質(zhì)期,；提高樣品蛋白含量,；設內(nèi)參對照，轉(zhuǎn)膜對照,；轉(zhuǎn)膜效果的檢查,；減少洗膜時間

降低封閉液濃度，減少封閉時間,；延長曝光時間

三,、雜帶過多

原因：

蛋白樣本具有多種修飾；蛋白樣本降解,；蛋白存在二聚體或多聚體,；一抗二抗?jié)舛冗^高；多克隆抗體

方案：

使用去修飾的試劑,；使用蛋白酶抑制劑,；電泳上樣前，煮沸10 min,，以增強蛋白質(zhì)解聚變性,；降低抗體濃度,；選用單克隆抗體

四、其他問題

1.背景白色條帶 → 轉(zhuǎn)膜時有氣泡或抗體分布不均

2.暗片現(xiàn)白條帶 → 一抗或二抗加入過多

3.目的條帶過低/過高 → 膠濃度不合適

4.“微笑"條帶 → 遷移過快,、電泳溫度過高