乙酰輔酶 A（Acetyl-CoA）含量測定試劑盒說明書

分光光度法 25 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義

乙酰輔酶 A 廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì),。糖,、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化,，經(jīng)過這條通路氧化生成二氧化碳和水,，釋放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰輔酶A 是合成脂肪酸,，酮體,，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

測定原理

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD 生成草酰乙酸和NADH,。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A,。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比,，340nm 下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶 A 含量的高低,。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：液體 25mL×1 瓶,，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 支,，-20℃保存,。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

試劑三：液體 10μL×1 支，4℃保存,。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑四：粉劑×1 瓶,，-20℃保存。臨用前加入 22.5mL 試劑五充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體 30mL×1 瓶,，4℃保存,。

工作液的配制：臨用前請根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92  m  L），將試劑二,、三和四按照 1:1:90 的比例混合,，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測定 24 樣）；加樣前置 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱 30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用,；

乙酰輔酶 A 的提取

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量

（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,； 8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）,，進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

測定步驟

1、 分光光度計預(yù)熱 30min,，用蒸餾水于 340nm 處調(diào)零,。

2、取 920μL 工作液和 100μL 樣本至 1mL 石英比色皿,，混勻,，立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 80s 時的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1,。

乙酰輔酶 A 含量計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012,；x 為吸光值，y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）,。

注意：本試劑盒低檢測限為 1.6nmol/mL,。

（1） 按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,。

（2） 按照樣本質(zhì)量計算

乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)

÷W

(3 )  按照細菌或細胞密度計算：

乙酰輔酶 A 含量(nmol/10⁴)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.1mL；V2：加入提取液體積,，1 mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬,。

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