實驗分享 | 競爭法ELISA實驗操作指南

　　一,、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋及樣品準(zhǔn)備

　　樣本4℃，1000Xg 5min

　　標(biāo)準(zhǔn)品4℃，10000Xg 1min

　　1mL稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品,，靜置1-2min,，每管加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液，靜置后標(biāo)準(zhǔn)品混勻,，將液體離心至底部(800Xg 1min)

　　取同體積標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋,，渦旋混勻，依次倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,，最后一管為空白

　　二,、生物素化抗體工作液制備

　　取5940μL生物素化抗體稀釋液，加入60μL濃縮液,，稀釋100倍后,，備用

　　顛倒混勻20次，備用

　　三,、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本,、檢測抗體點樣

　　由低到高濃度，懸空加入,，每孔加入50μL,，處理后的樣品上清溶液，懸空,，每孔50μL,，生物素化抗體工作液，懸空加入,，每孔50μL,，腹膜后，標(biāo)記簡稱,。

　　提前預(yù)熱,，注意溫度：37℃孵育45min，1*洗液配制,，取288mL雙蒸水,，取25*濃縮洗滌液12mL，加入燒杯,，磁力攪拌器混勻5-10min,。

　　四、HRP酶結(jié)合物工作液制備

　　取11880μLHRP酶結(jié)合物稀釋液,，加入120μL濃縮液,，稀釋100倍后，備用,。

　　顛倒混勻20次,，備用。

　　平衡取出酶標(biāo)板，勿觸摸板條底部,。輕撕覆膜,，避免液體濺出。參數(shù)設(shè)定(洗滌次數(shù)3次,、洗板條數(shù)12條,、洗滌液量350μL/孔、震板5s)

　　拍干液體,，更換吸水紙

　　懸空垂直加入HRP酶結(jié)合物工作液，每孔100μL,，腹膜后,，標(biāo)記。37℃孵育30min,，平衡取出酶標(biāo)板,，勿觸摸板條底部，洗滌(參數(shù)設(shè)定：洗滌次數(shù)5次,、洗板條數(shù)12條,、洗滌液量350μL/孔、震板5s)

　　拍干液體,，更換吸水紙

　　五,、顯色

　　懸空垂直加入底物溶液，每孔90μL,，腹膜后,，標(biāo)記，37℃孵育15-30min,，平衡取出酶標(biāo)板,，切勿觸摸板條底部，顯色后四孔出現(xiàn)明顯藍色梯度,。

　　六,、終止反應(yīng)

　　懸空垂直加入終止液，每孔50μL,，加入終止液時可看到藍色立轉(zhuǎn)為黃色,。

　　七、數(shù)據(jù)處理

　　輕輕擦拭板底,，放入酶標(biāo)儀中,，上機操作。

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