ELISA實(shí)驗(yàn)-如何降低ELISA背景

　　ELISA實(shí)驗(yàn)的原理似乎很簡單,，不外乎固定抗原,，添加一抗、二抗和底物,，間中夾雜著洗滌和封閉,。如何降低ELISA的背景，下面便是BUNSEN本生技術(shù)的詳解：

　　1 洗滌很重要

　　洗滌步驟看似很無聊,，其實(shí)很重要,，因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中，那么它會增加背景噪音,。如有必要,，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會阻止非特異結(jié)合反應(yīng),。如果背景過高,，而您懷疑洗滌不夠時，可以嘗試增加洗滌次數(shù),。

　　2 封閉更關(guān)鍵

　　封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn),。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧,。如果您的背景過高,，懷疑封閉不充分，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,，或適當(dāng)延長封閉時間,。

　　如果您一直被背景問題所困擾，那么也許您該花些時間來優(yōu)化封閉液,。這可能需要時間,，但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑,。您使用的類型須取決于多個因素，包括微孔板的表面試劑,、吸附的抗原,、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原,、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用,。

　　常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜,、穩(wěn)定,，在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時起作用,，因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),，它會降低特異結(jié)合,，產(chǎn)生假陰性。另一個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉,。

　　蛋白封閉液則有所不同，,。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,，同時穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA),、脫脂奶粉,、正常血清和魚明膠。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用,。不過,，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清,。

　　3 抗體濃度須優(yōu)化

　　記住,，非特異的抗體結(jié)合會增加背景。為了防止這一點(diǎn),，切勿使用過多的一抗或二抗,。

　　4 檢測試劑要適量

　　切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高,，或者未正確稀釋,，則會導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度,，如有必要,，優(yōu)化一下何時應(yīng)加入終止液。

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