細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見問題及解決方案

　　細(xì)胞培養(yǎng)是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),，在細(xì)胞生長過程中，很多因素都會(huì)造成細(xì)胞生長不良,。下面BUNSEN本生簡(jiǎn)單歸納一下細(xì)胞生長不良的原因及對(duì)應(yīng)的解決方案,。

　　常見問題一：為什么細(xì)胞解凍后缺少活力，活細(xì)胞占比較低?

　　這種現(xiàn)象可能主要由以下幾種原因所導(dǎo)致：

　　1.培養(yǎng)物凍存液等質(zhì)量欠缺,。

　　解決方案：

　　a.確保用來制備儲(chǔ)存物(凍存液)的起始培養(yǎng)物需要保證其健康,、無微生物污染、處于生長對(duì)數(shù)期后期狀態(tài),。

　　b.收獲細(xì)胞時(shí)需要小心翼翼,，避免細(xì)胞損傷。

　　2.儲(chǔ)存物凍存方法不當(dāng)

　　解決方案：

　　a.在液氮冷凍細(xì)胞時(shí),，確保細(xì)胞,、培養(yǎng)基和其他試劑的濃度，以及凍存實(shí)驗(yàn)步驟依照供應(yīng)商的建議。一般來說,，凍存應(yīng)該緩慢,，大約1-3° C/min以減少冰晶形成。

　　b.使用電子可編程或機(jī)械冷凍裝置以確保一致的,、適當(dāng)速率的冷凍,。

　　c.選擇最合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。如果使用甘油,，不要將其存儲(chǔ)在光照下,，因?yàn)槠毓鈺?huì)使甘油轉(zhuǎn)化為有對(duì)細(xì)胞毒性的。

　　3.儲(chǔ)存物保存不當(dāng)

　　解決方案：

　　a.儲(chǔ)存物應(yīng)時(shí)刻保持在-130℃,，理想情況是置于液氮中,，以確保較大的細(xì)胞活性。

　　b.如果將細(xì)胞直接浸入液氮中,，容易造成液氮泄露到凍存管內(nèi),，解凍時(shí)會(huì)有凍存管爆炸的風(fēng)險(xiǎn),。所以一般儲(chǔ)存在液氮上方的氣相環(huán)境中,。

　　4.細(xì)胞解凍方法不當(dāng)

　　解決方案：

　　a.一般來說，細(xì)胞應(yīng)該快速解凍,、使用預(yù)熱的培養(yǎng)基,、盡快移除含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基防止細(xì)胞活力下降。

　　b.確保小心操作細(xì)胞,。不要渦旋或高速離心,，因?yàn)榈蜏乇４婧蟮奶貏e容易受到損傷。

　　常見問題二：細(xì)胞進(jìn)行解凍或傳代后細(xì)胞的附著力偏低?

　　這種情況主要是因?yàn)闈穸冗^低致使培養(yǎng)容器上集聚靜電所致,。

　　可以通過適當(dāng)增加房間濕度,，使用防靜電裝置或者用消毒過的濕毛巾擦拭培養(yǎng)容器外側(cè)，來減低靜電產(chǎn)生,。另外試劑混合不均勻,，培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)速等因素也可導(dǎo)致此現(xiàn)象發(fā)生。所以在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),，要確保細(xì)胞和所有試劑的溶液混合充分,。在使用振蕩培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，注意設(shè)置適宜的轉(zhuǎn)速,。

　　常見問題三：為什么細(xì)胞生長速度緩慢?

　　細(xì)胞生長過慢有很多原因,，其主要原因如下：

　　1.細(xì)胞的傳代次數(shù)太多，所以獲得一個(gè)新的,、亞培養(yǎng)次數(shù)較少的細(xì)胞儲(chǔ)存液很有必要,。

　　2.未選擇合適的細(xì)胞收獲時(shí)機(jī)。

　　在使用新的細(xì)胞儲(chǔ)存液的同時(shí)，也要把我好適宜的細(xì)胞收獲時(shí)機(jī),，一般在對(duì)數(shù)生長期的后期是細(xì)胞收獲時(shí)間當(dāng)細(xì)胞達(dá)到*融合后,，由于生長過于擁擠，會(huì)逐漸進(jìn)入緩慢生長階段,，此時(shí),，細(xì)胞的活躍度也會(huì)隨之下降。

　　培養(yǎng)基,、血清,、緩沖液等質(zhì)量差，或者配方不合理,。培養(yǎng)基,、血清等培養(yǎng)物質(zhì)是細(xì)胞生長的主要營養(yǎng)來源，所以其質(zhì)量直接會(huì)影響到細(xì)胞的生長狀態(tài),。所以高質(zhì)量的培養(yǎng)基及合理的試劑配方維持細(xì)胞的良好生長具有決定的作用,。

　　3.CO2濃度與緩沖系統(tǒng)需求不匹配，導(dǎo)致pH控制不足,。

　　一般來說,，細(xì)胞培養(yǎng)液中緩沖液中NaHCO3的濃度與CO2濃度成正比例關(guān)系。緩沖液中NaHCO3 的濃度高,，所需求的CO2濃度也較高;這樣才能達(dá)到PH平衡,。

　　4.微生物污染，尤其是支原體

　　及時(shí)檢查污染,，防止微生物污染,，做好支原體、器皿,、環(huán)境消毒,、支原體清除等工作。

　　5.培養(yǎng)物光敏降解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì),。

　　如果培養(yǎng)基長時(shí)間暴露于熒光將會(huì)導(dǎo)致光敏感培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性自由基和H2O2,，從而影響到細(xì)胞生長甚至細(xì)胞凋亡。所以平時(shí)要在暗處保存細(xì)胞核培養(yǎng)基,，避免熒光暴露,。

　　6.不精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法將導(dǎo)致細(xì)胞生長不良

　　a.確保計(jì)數(shù)樣本充分混合，避免局部細(xì)胞密度差異影響精確計(jì)數(shù)

　　b.再次檢查使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的所有運(yùn)算

　　常見問題四：為什么細(xì)胞生長會(huì)不均勻?

　　1.細(xì)胞或培養(yǎng)基的混合不充分：在培養(yǎng)基中接入細(xì)胞后應(yīng)當(dāng)輕搖混勻,，在進(jìn)入振蕩培養(yǎng)箱后,，保證持續(xù)穩(wěn)定的振幅頻率，避免局部濃度差異,。

　　2.在細(xì)胞培養(yǎng)過程中有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)同一時(shí)期相同器皿之間細(xì)胞生長不平衡,。

　　這種情況可能是由于培養(yǎng)箱內(nèi)部的溫度不均一所導(dǎo)致。注意做好以下兩點(diǎn)：

　　a.避免將培養(yǎng)器皿疊放，因?yàn)榈撞康呐囵B(yǎng)器皿最靠近金屬架可能加熱最快,。

　　b.如果放在培養(yǎng)箱前部的培養(yǎng)器皿比后面的生長慢,，要注意保持培養(yǎng)箱的門盡可能關(guān)嚴(yán)，并將前面的培養(yǎng)器皿移到后面,。