原發(fā)登革熱IgG間接法檢測(cè)試劑

Panbio Dengue IgG Indirect ELISA 

產(chǎn)品目錄號(hào)01PE30

預(yù)期用途

Panbio Dengue IgG Indirect ELISA用于定性檢測(cè)登革熱病原血清型（1,、2,、3和4）血清中的IgG抗體，輔助臨床實(shí)驗(yàn)室診斷出現(xiàn)臨床癥狀或既往感染登革熱病毒的患者,。

概述

蟲媒病毒中的登革熱屬通過(guò)蚊子傳播,，主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊。 登革熱病毒感染,，與傷寒病有關(guān),，其特征是突然發(fā)熱、劇烈頭痛,、肌痛,、關(guān)節(jié)痛和皮疹。 登革熱感染的嚴(yán)重并發(fā)癥包括登革出血熱和登革休克綜合征,。此類并發(fā)癥的發(fā)病率增加與繼發(fā)性感染不同登革熱血清型有關(guān),。

通過(guò)ELISA對(duì)四種登革熱血清型的IgG類特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，是一種診斷既往感染登革熱病毒的患者的重要方法,。 配對(duì)血清中IgG,， 水平不斷升高是活動(dòng)性登革熱感染的表現(xiàn)。傳統(tǒng)上，血凝抑制試驗(yàn)（HAI）滴度被用于劃分原發(fā)性或繼發(fā)性感染,。當(dāng)前的界定方法是采用及時(shí)分離至少7天的配對(duì)血清標(biāo)本檢測(cè),，急性標(biāo)本的HAI滴度≥ 1:2560被認(rèn)為患者感染了繼發(fā)性黃病毒¹。

檢測(cè)原理

血清中存在的登革熱病毒抗體,，與微孔測(cè)試條上聚苯乙烯表面附著的登革熱抗原結(jié)合物相結(jié)合,。 洗去剩余的血清并添加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。清洗微孔,，再添加無(wú)色的底物系統(tǒng) - 四甲基聯(lián)苯胺/過(guò)氧化氫（TMB顯色液）,。底物被酶水解后，顯色液變藍(lán),。用酸終止反應(yīng)后,，TMB變黃。顯色表示測(cè)試樣本中存在登革熱IgG抗體,。

提供的材料

• 登革熱抗原（血清型1,、2、3和4）包被微孔板-（12x8孔）,。即用型。未使用的微孔應(yīng)該立即重新密封并儲(chǔ)存于干燥環(huán)境中,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定,。
• 清洗緩沖液（20倍） - 1瓶，60mL 20倍濃縮磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.2 – 7.6）,，含吐溫 20和防腐劑（0.1% Proclin™）,。低溫可能結(jié)晶。若去除結(jié)晶,，可在37℃孵育液體至澄清,。混合均勻,。用19體積的蒸餾水稀釋1體積的清洗緩沖液,。稀釋后的緩沖液可在2-25℃儲(chǔ)存一周。
• 樣本稀釋劑 – 2瓶,， 50 mL（粉色）,。即用型。Tris緩沖生理鹽水（pH 7.2 – 7.6）,，含防腐劑（0.1% Proclin™）和添加劑,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• HRP標(biāo)記抗人IgG – 1瓶,，15mL（綠色）,。即用型。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗人IgG，含防腐劑（0.1% Proclin™）和蛋白穩(wěn)定劑,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定,。
• TMB顯色液（TMB） - 1瓶，15mL,。即用型,。3,3’,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫的混合物，存放于枸櫞酸鹽緩沖液中（pH 3.5 – 3.8）,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定,。
• 陽(yáng)性質(zhì)控品 – 1瓶，紅色瓶蓋,，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
•  校準(zhǔn)品 – 1瓶,，黃色瓶蓋,，850μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定,。
• 陰性質(zhì)控品 – 1瓶,，綠色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8℃可保持穩(wěn)定,。
• 終止液 – 1瓶，紅色瓶蓋,，15mL,。即用型。1M磷酸,。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-25℃可保持穩(wěn)定,。

Proclin™ 300是Rohm 和Haas公司的注冊(cè)商標(biāo)。

需要但未提供的材料

• 精確,、可調(diào)節(jié)的微量移液器,，含一次性吸液頭（5-1000 μL容積）
• 去離子水
• 標(biāo)板清洗系統(tǒng)
• 酶標(biāo)儀，含450nm濾波器
• 計(jì)時(shí)器
• 刻度量筒
• 燒瓶
• 試管或微滴定板,，用于稀釋血清

注意事項(xiàng)

用于體外診斷

• 在制備質(zhì)控品的過(guò)程中使用的所有人源性材料已經(jīng)過(guò)人類免疫缺陷病毒1/2（HIV 1 /2）抗體,、丙肝（HCV）和乙肝表面抗原的檢測(cè)，結(jié)果為陰性,。但是,，任何測(cè)試方法都不能*確信，且所有人源性質(zhì)控品和抗原包被微孔板都應(yīng)按照潛在傳染性材料處理,。疾病控制和預(yù)防中心以及美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院建議將潛在傳染原按照生物安全二級(jí)²處理,。
• 該測(cè)試只能使用血清執(zhí)行,。尚未建立使用全血、血漿或其它標(biāo)本基質(zhì)的方法,。
• 不可使用黃疸或脂血癥血清,，以及出現(xiàn)溶血或微生物生長(zhǎng)的血清。
• 不可加熱,，否則血清將失去活性,。
• 在開始檢測(cè)前所有試劑必須平衡至室溫（20-25℃）。檢測(cè)受溫度變化的影響,。微孔板在達(dá)到室溫（20-25℃）之前不可從密封袋中取出,。
• 直接用干凈的吸液頭從試劑瓶中吸出試劑。轉(zhuǎn)移試劑可能導(dǎo)致污染,。
• 未使用的微孔應(yīng)該立即重新密封并儲(chǔ)存于干燥環(huán)境中,。否則將產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。
• 底物系統(tǒng)：
  • 由于TMB易受金屬離子的污染,，所以底物系統(tǒng)不能與金屬表面接觸,。
  • 避免長(zhǎng)時(shí)間陽(yáng)光直射。
  • 有些清潔劑可干擾TMB的性能,。
• TMB可能呈現(xiàn)淡藍(lán)色,，這不影響底物的活性或測(cè)定結(jié)果。累積,。
• 疊氮話鈉還抑制酶標(biāo)物的活性,。在添加酶標(biāo)物時(shí)必須使用干凈的吸液頭，避免攜帶其它試劑的疊氮話鈉,。

標(biāo)本采集和制備

靜脈穿刺獲取的血液應(yīng)該置于室溫（20-25℃）下直到凝塊形成，再按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院（CLSI）的《認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)——診斷用血液標(biāo)本的靜脈穿刺采集程序,，H3》離心,。應(yīng)該盡快分離血清。如果在2天內(nèi)不進(jìn)行檢測(cè),，血清應(yīng)該2-8℃冷藏或者低于或等于- 20℃冷凍儲(chǔ)存,。不*使用自解凍冷凍機(jī)儲(chǔ)存血清。不*使用黃疸血清,，以及出現(xiàn)溶血,、脂血或微生物生長(zhǎng)的血清。CLSI提供了儲(chǔ)存血液標(biāo)本的建議,，《認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)——血液標(biāo)本的處理加工程序,，H18》。

檢測(cè)程序

注： 確保所有試劑在開始測(cè)定前平衡至室溫（20-25℃）,。在所給時(shí)間和溫度范圍以外進(jìn)行測(cè)試可能產(chǎn)生無(wú)效的結(jié)果,。不在預(yù)定時(shí)間和溫度范圍內(nèi)的測(cè)試必須進(jìn)行重復(fù)。

ELISA程序

• 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板并插入測(cè)試條槽。陰性質(zhì)控品,、陽(yáng)性質(zhì)控品和校準(zhǔn)品各需5個(gè)微孔,，一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內(nèi),。
• 使用適當(dāng)?shù)脑嚬芑蛭⒌味ò逑♂岅?yáng)性質(zhì)控品（P）,、陰性質(zhì)控品（N）、校準(zhǔn)品（CAL）和患者樣本,。
  • 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑,。混合均勻,。 

或者,，

• 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清,，加入180μL樣本稀釋劑,。混合均勻,。

• 吸取100 µL樣本稀釋劑,、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品添加至對(duì)應(yīng)的微孔中。
• 蓋住測(cè)定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘,。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）,。
• 吸取100 µL HRP標(biāo)記抗人IgG添加到每個(gè)微孔中。
• 蓋住測(cè)定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘,。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）,。
• 吸取100 µL TMB添加到每個(gè)孔中。
• 在室溫（20-25℃）下孵育10分鐘,，從第①次添加開始計(jì)時(shí),。藍(lán)色將會(huì)顯現(xiàn)。
• 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個(gè)孔中,，計(jì)時(shí)同TMB添加步驟,。混合均勻,。藍(lán)色將變成黃色,。
• 在30分鐘內(nèi)讀取每個(gè)孔在450nm波長(zhǎng)的吸光度，參考濾波器為600-650nm,。

注： 如果使用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì),，將參考濾波器設(shè)定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結(jié)果可能由于背景原因?qū)е挛舛绕摺?/span>

清洗程序

為了清除未復(fù)合的樣本或成分,，有效清洗是ELISA程序的關(guān)鍵步驟,。

A.自動(dòng)洗板機(jī)

• *抽凈所有微孔,。
• 在清洗循環(huán)期間將每個(gè)孔裝滿至邊緣（350μL）。
• 完成6次清洗后,，將測(cè)定板倒立于吸水紙巾上用力敲打,，確保清除所有清洗緩沖液。
• 為了確保有效清洗,，必須維持自動(dòng)洗板機(jī)良好的保養(yǎng),。必須始終遵守廠商的清潔說(shuō)明。

B.手動(dòng)清洗

• 將測(cè)定板的內(nèi)含物丟棄到適當(dāng)?shù)膹U物容器,。
• 用適當(dāng)?shù)臄D壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液,。避免清洗緩沖液起泡，否則會(huì)降低清洗效率,。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液,。
• 再將微孔填滿清洗緩沖液，并立即丟棄,。
• 重復(fù)步驟（3）4次,，共用清洗緩沖液清洗六（6）次。
• 后一次清洗完成后,，丟棄微孔的內(nèi)含物并將測(cè)定板置于吸水紙巾上敲打,，以確保清除所有清洗緩沖液。

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