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液相色譜分類及基礎(chǔ)原理
液相色譜分類及基礎(chǔ)原理
液相色譜是一類分離與分析，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相,，固定相可以有多種形式,，如紙、薄板和填充床等,。在色譜發(fā)展的過程中,。為了區(qū)分多種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名,，如紙色譜,、薄層色譜和柱液相色經(jīng)典液相色譜的流動(dòng)相是依靠重力緩慢地流過色譜柱，因此固定相的粒度不可能太?。?00μm～150μm左右）,。分離后的樣品是被分級(jí)收集后再進(jìn)行分析的，使得經(jīng)典液相色譜分離效率低,、分析速度慢,，而且操作也比較復(fù)雜。直到20世紀(jì)60年代,。發(fā)展出粒度小于10μm的固定相,，并使用了高壓輸液泵和自動(dòng)記錄的檢測(cè)器，克服了經(jīng)典液相色譜的缺點(diǎn)，發(fā)展成液相色譜,，也稱為高壓液相色譜,。
液相色譜按其分離機(jī)理，可分為四種類型,。
一,、吸附色譜法
吸附色譜法的固定相為吸附劑，色譜的分離過程是在吸附劑表面進(jìn)行的,，不進(jìn)入固定相的內(nèi),。與氣相色譜不同，流動(dòng)相（即溶劑）分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用,。在吸附劑表面,，樣品分子與流動(dòng)相分子進(jìn)行吸附競(jìng)爭(zhēng)，因此流動(dòng)相的選擇對(duì)分離效果有很大的影響,，一般可采用梯度淋洗法來提色譜分離效率,。
在聚合物的分析中，吸附色譜一般用來分離添加劑,，如偶氮染料,、抗氧化劑、表面活性劑等,，也可用于石油烴類的組成分析,。
二、分配色譜法
這種色譜的流動(dòng)相和固定相都是液體,，樣品分子在兩個(gè)液相之間很快達(dá)到平衡分配,，利用各組分在兩相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，類似于萃取過程,。
一般常用的固定液有β,β\'-氧二（ODPN）和角鯊?fù)椋⊿Q）,。采用與氣相色譜（GC）同樣的方法，將固定液涂漬在多孔的載體表面,，但在使用中固定液易流失,。目前，應(yīng)用較多的是鍵合固定相,。在這種固體相中,，固定液不是涂在載體表面，而是通過化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機(jī)基團(tuán),。
例如,，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基（-OH）之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面。這種固定液的優(yōu)點(diǎn)是不易被流動(dòng)相剝蝕,。在分配色譜法中,，流動(dòng)相可為純?nèi)軇?，也可以采用混合溶劑進(jìn)行梯度淋洗，其極性應(yīng)與固定液差別大一些,，以防兩者之間相溶,。通常可分為正相分配和反相分配,。
三,、離子交換色譜
離子交換色譜通常用離子交換樹脂作為固定相。一般是樣品離子與固定相離子進(jìn)行可逆交換,，由于各組分離子的交換能力不同,，從而達(dá)到色譜的分離。
離子交換色譜法是新發(fā)展起來的一項(xiàng)現(xiàn)代分析技術(shù),，已大范圍用于氨基酸,、蛋白質(zhì)的分析，也適合于某些無機(jī)離子（NO3-,、SO42-、Cl-等無機(jī)陰離子和Na+,、Ca2+,、Mg2+、K+等無機(jī)陽離子）的分離和分析,，具有重要的作用,。
四、凝膠色譜法
目前,，凝膠色譜法既適用于水溶液的體系,，又適用于有機(jī)溶劑的體系。當(dāng)所用的洗脫劑為水溶液時(shí),，稱為凝膠過濾色譜,，其在生物界的應(yīng)用比較多；采用有機(jī)溶劑為洗脫劑時(shí),，稱為凝膠滲透色譜,，在高分子領(lǐng)域應(yīng)用較多。
基本原理
使用液相色譜時(shí),，液體待檢測(cè)物被注入色譜柱,，通過壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱,，通過檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，后通過分析比對(duì)這些信號(hào)來判斷待測(cè)物所含有的物質(zhì),。液相色譜作為一種重要的分析方法,，應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵,、高敏度檢測(cè)器和微粒固定相,，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大,、不同極性的有機(jī)化合物,。
什么是液相色譜法（HPLC）?
縮寫 HPLC，引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會(huì)上的文章,，原指在填料柱中產(chǎn)生所需的流速需要高壓,。早期的泵只能承受500 psi （35bar）。這就被稱為高壓液相色譜法（HPLC）七十年代早期取得大進(jìn)步,。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6000psi（400 bar）的壓力,，還能配上改進(jìn)的進(jìn)樣器，檢測(cè)器和色譜柱,。高壓液相色譜法確實(shí)開始成為二十世紀(jì)七十年代中晚期的普遍分析方法,。隨著這一期間不斷的性能改進(jìn)（小顆粒，高壓力）,，字母縮寫保持一樣,，但全稱變?yōu)椋╤igh-performance） 液相色譜（HPLC）。液相色譜（HPLC）是目前分析化學(xué)的工具之一,。它能夠分離,、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天,，痕量化合物甚至低至千萬分之一也可,。
一個(gè)儲(chǔ)液瓶裝有溶劑（稱為流動(dòng)相，因?yàn)槿軇┦橇鲃?dòng)的）,。一個(gè)高壓泵（溶劑傳輸系統(tǒng)或稱溶劑管理器）用來產(chǎn)生和計(jì)量流動(dòng)相的流速,，一般是毫升/分鐘。一個(gè)進(jìn)樣器（樣品管理器或自動(dòng)進(jìn)樣器）可以將樣品導(dǎo)入（注射）連續(xù)的流動(dòng)相,，并由流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入液相色譜柱,。色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱為固定相因?yàn)樗恢布鼑?。檢測(cè)器用來查看化合物流出色譜柱時(shí)被分開的譜帶（大多數(shù)化合物沒有顏色,，所以人眼觀察不到）。流動(dòng)相流出檢測(cè)器可被送至廢液瓶,，或按需被收集,。當(dāng)流動(dòng)相含有一個(gè)分開的化合物譜帶，液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分,，用于進(jìn)一步分析,。這種方法稱為制備液相（在液相色譜量級(jí)中討論）,。注意高壓管路和附件用來連接泵、進(jìn)樣器,、色譜柱和檢測(cè)器單元,，形成流動(dòng)相、樣品和化合物分離譜帶的通路,。
檢測(cè)器連接計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)站,，液相色譜系統(tǒng)單元先記錄電信號(hào)，再將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為色譜圖,，在顯示屏上展現(xiàn)出來,。定性和定量樣品內(nèi)溶物濃度。由于樣品中化合物性質(zhì)差異很大,，幾種類型的檢測(cè)器被開發(fā)出來,。例如，如果一個(gè)化合物能吸收紫外光,，可使用紫外吸收檢測(cè)器,。如果這個(gè)化合物發(fā)熒光，可使用熒光檢測(cè)器,。如果該化合物沒有上述性質(zhì)之一,，可使用的檢測(cè)器，如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）,。方式是順序使用多個(gè)檢測(cè)器。例如,，紫外和/或蒸發(fā)光檢測(cè)器可和質(zhì)譜儀（MS）聯(lián)用來分析色譜分離的組分,。這樣，從一次進(jìn)樣,，可得到分析物的多綜合的信息,。將質(zhì)譜與液相色譜系統(tǒng)耦合稱之為液質(zhì)聯(lián)用。