雞馬立克氏病核酸試劑盒

【預(yù)期用途】

?雞馬立克氏病核酸試劑盒

馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細胞浸潤和增大,，引起肢(翅)麻痹,，以及性腺、虹膜,、各種臟器,、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評估有重要指導意義.

【檢驗原理】

本試劑盒針對MDV高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號,。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

注：陰性對照為雞基因組DNA,，陽性對照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融,，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,，采集方法如下：

(1) 咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液,；

(2) 泄殖腔拭子,，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；

(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用,。

2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。

3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢,。

4.應(yīng)避免標本間交叉污染。

5.標本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量,。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl,、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。

【預(yù)期用途】

馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細胞浸潤和增大，引起肢(翅)麻痹,，以及性腺,、虹膜、各種臟器,、肌肉和皮膚腫瘤病,。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評估有重要指導意義.

【檢驗原理】

本試劑盒針對MDV高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

注：陰性對照為雞基因組DNA，陽性對照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,，采集方法如下：

(1) 咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次～5次,，取咽喉分泌液；

(2) 泄殖腔拭子,，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便,；

(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。

2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。

3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨,，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢,。

4.應(yīng)避免標本間交叉污染,。

5.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存，標本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融,。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性,，否則為陰性,。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。