高致病性豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)試劑盒

高致病性豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）規(guī)格：50T/盒

配件
高致病性豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）的組成

2. 標(biāo)本采集,，方法如下：注：陰性對(duì)照為基因組DNA,，陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的病毒cDNA,。
儲(chǔ)存方式
避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月,。
【適用儀器 】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,。
標(biāo)本要求
1. 適用標(biāo)本類(lèi)型：發(fā)病動(dòng)物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織,、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液,。

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,，密閉送檢,。

(2) 腸內(nèi)容物：無(wú)菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中,，立即送檢,。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動(dòng)物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中,，密閉送檢,。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè),；若不能立即檢測(cè),，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】高致病性豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)試劑盒

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl,、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器 上,。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器 上。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器 核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

操作流程

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

適用范圍 【參考值】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)或Ct值≤35,。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值,，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期,。

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的*檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 高致病性豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）的*檢出限為10² Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%,。

操作流程

1. 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服,、儀器 ,、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用,；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作,；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線(xiàn)殺菌裝置,。

2. 為避免RNA降解，樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè),；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。

3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰,、陽(yáng)性對(duì)照,。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心,。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器 擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用,。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None,。

9. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄,。