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注意事項(xiàng)
1,、必須活細(xì)胞檢測(cè)，不能用能破壞細(xì)胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜,。
2,、特殊細(xì)胞的染色方法：在消化或吹打時(shí)，有些細(xì)胞（如神經(jīng)元細(xì)胞）很容易受到損傷,，導(dǎo)致晚期凋亡或壞死比例非常高,，不能反映真實(shí)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)的解決方法：先低速離心,，吸取細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體,，留少許液體，加入適量PI和Annexin-V染色10min后,，將漂浮細(xì)胞吸至離心管中,，離心洗滌兩次，用PBS漂洗貼壁細(xì)胞兩次,，加胰酶消化后將細(xì)胞懸液移至另一離心管中,，離心洗滌,，再與漂浮細(xì)胞合并后上流式細(xì)胞儀檢測(cè),。應(yīng)用該法可降低晚期凋亡和壞死比例，增加早期凋亡細(xì)胞比例,。
3,、由于Annexin-V為鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，只有在鈣離子存在的情況下與PS的親和力才大,，因而在消化細(xì)胞時(shí),，建議一般不采用含EDTA的消化液。
4,、必須設(shè)置陰性對(duì)照和補(bǔ)償對(duì)照（分別單染）,。
流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)與流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)實(shí)驗(yàn)步驟相近：
1. 凋亡細(xì)胞的制備
小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺,，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為2×106 /ml,，備用。
2. 200 μl細(xì)胞懸液加入1 ml冷PBS,，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘,，棄上清,。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細(xì)胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液,。
流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)和流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)注意事項(xiàng)：
1. 整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔,，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作,。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè),，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開始衰變,。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì),，在操作時(shí)要注意避光。
流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)如何避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果,？細(xì)胞接種不易過密：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞時(shí)密度不要＞1*106,，以免細(xì)胞培養(yǎng)過程中自身引起凋亡，而非外界處理因素,；
避免消化過度：因消化過度可能會(huì)造成PS外翻,，得到假陽性的結(jié)果。因此消化時(shí)最好用低濃度胰酶消化,，輕柔吹打貼壁細(xì)胞2-3次,，盡量把胰酶造成損傷可以控制在5%以內(nèi)，加上對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響,；
操作盡量輕柔：收集細(xì)胞時(shí)力度過大很可能造成細(xì)胞膜損傷,，導(dǎo)致細(xì)胞膜的磷脂層暴露，從而結(jié)合Annexin V,，導(dǎo)致假陽性,，因此處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷,。
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,，其原理是生物素biotinylate標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端,，并與連接辣根過氧化酶（HRP,，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合，后者又與POD底物H2O2,、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng),，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂,，因而沒有3‘-OH形成,，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋,、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè),。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段,。
tunel流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法,。對(duì)于經(jīng)過固定和洗滌的細(xì)胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應(yīng),，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)檢測(cè)到呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細(xì)胞,。
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細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一件主動(dòng)性細(xì)胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活,、表達(dá)以及調(diào)控,，是細(xì)胞為更好地適應(yīng)環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。具體表現(xiàn)為：出芽形成凋亡小體,、核小體間DNA的切割,，凋亡小體被吞噬和消化等幾個(gè)連續(xù)過程等.
細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA,。細(xì)胞凋亡時(shí)
抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder,?；蚪MDNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上綠色熒光探針熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP),，從而可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)進(jìn)行檢測(cè),，這就是TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。注：FITC是fluorescein isothiocyanate的縮寫,，實(shí)際上大多數(shù)情況下所謂的FITC即為fluorescein,。
有如下優(yōu)點(diǎn)：
(1)高靈敏度：背景染色極低,，陽性染色明亮,，可以在單細(xì)胞水平檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于凋亡早期就有DNA斷裂,，可以檢測(cè)到早期的細(xì)胞凋亡,。
(2)特異性：TUNEL檢測(cè)時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞,。
(3)快速：僅需約1-2個(gè)小時(shí)即可完成,。
(4)方便：只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可觀察,，不必使用二抗等進(jìn)行多步操作,。
(5)應(yīng)用范圍廣：可以用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況,，也可以檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。
TUNEL法特異性檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂,，但不會(huì)檢測(cè)出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同),。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞,。
極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂,，此時(shí)不適用TUNEL法檢測(cè)。在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測(cè)呈陽性,。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下,，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)凋亡指標(biāo)。
細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一,，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育,、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生,。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過度有關(guān),，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死,，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變,，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解,、凋亡小體形成等,。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine,， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中,。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合,。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC,、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針,，利用流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,。
