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賽爾瑞成（北京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司
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一、細(xì)胞培養(yǎng)前期準(zhǔn)備工作
細(xì)胞培養(yǎng)儀器設(shè)備：
◆ 細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥（即生物安全柜）
◆ 培養(yǎng)箱（通用推薦：濕式二氧化碳培養(yǎng)箱）
◆ 離心機(jī)
◆ 醫(yī)用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）,、生物超低溫冰箱（-80℃）、液氮冷凍罐
◆ 倒置顯微鏡
其他用品：細(xì)胞培養(yǎng)容器（培養(yǎng)瓶,、培養(yǎng)皿,、多孔板等）,，吸管和移液器,，培養(yǎng)基,、血清和試劑
注意事項(xiàng)：
◆ 無(wú)菌工作區(qū)域：細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的主要要求是需要維持細(xì)胞培養(yǎng)操作工作區(qū)域處于無(wú)菌狀態(tài)，簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的方式就是使用細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥,。
◆ 無(wú)菌試劑和培養(yǎng)基：商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保無(wú)菌,，注意操作過(guò)程中不要被污染，其他試劑和溶液需要選擇適當(dāng)?shù)臏缇椒ǎɡ纾焊邏赫羝?、無(wú)菌過(guò)濾等）進(jìn)行滅菌,。
◆ 無(wú)菌操作：要求操作人員在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)工作區(qū)域和雙手操作部分進(jìn)行75%酒精消毒；盡量使用一次性塑料吸管進(jìn)行單次操作,，避免交叉污染,；試劑瓶和培養(yǎng)用具使用時(shí)方可開(kāi)蓋，用后要盡快蓋上,，暴露于環(huán)境中的時(shí)間盡可能要短,。
◆ 整體的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)境也彌足重要，需要定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行較為*的清掃消毒和殺菌,，包括實(shí)驗(yàn)用儀器和室內(nèi)地面,、桌面等,。
二,、細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存
細(xì)胞復(fù)蘇：
1. 在細(xì)胞狀態(tài)不足以滿足實(shí)驗(yàn)需求或者出現(xiàn)細(xì)胞污染的情況下，需要進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇：
2. 從超低溫冰箱或者液氮中取出自保存或商品化購(gòu)買的凍存細(xì)胞后,，快速轉(zhuǎn)移至37℃水浴條件下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)融化（一分鐘內(nèi)）,。
3. 75%酒精擦拭凍存管外部后，轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥中,。
4. 加入適量新鮮的*培養(yǎng)基混合,，約800-1000rpm下離心5-10分鐘,，實(shí)際離心速度時(shí)間取決于細(xì)胞種類和細(xì)胞狀態(tài)。
5. 新鮮培養(yǎng)基重懸后接種于相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中,，做好標(biāo)記,，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng),。
細(xì)胞凍存：
1. 為現(xiàn)有細(xì)胞系做細(xì)胞儲(chǔ)備,，需要對(duì)代數(shù)相對(duì)靠前的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)和細(xì)胞凍存：
2. 準(zhǔn)備細(xì)胞凍存液，置于2℃-8℃下備用,。
觀察待凍存的細(xì)胞,，密度達(dá)到80%-90%左右，將貼壁/懸浮細(xì)胞分別按照傳代方法收集,。
3. 使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行大致估算后,，計(jì)算出凍存溶液的體積，從而保證單支凍存細(xì)胞有足夠的細(xì)胞量用于復(fù)蘇,。
4. 約800-1000rpm下離心5-10分鐘,，無(wú)菌條件下小心棄去培養(yǎng)基，不要攪動(dòng)細(xì)胞沉淀,。
5. 用合適體積的預(yù)冷后凍存液重新混懸細(xì)胞沉淀,，分裝至凍存管中，做好標(biāo)記后進(jìn)行梯度降溫至液氮環(huán)境中保存,，入庫(kù),。
★★★對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存，需要進(jìn)行程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮）凍存,，為避免操作流程的繁瑣不可控,，可選用本公司自主研發(fā)的無(wú)血清非程序降溫細(xì)胞凍存液，包括Cellregen無(wú)血清細(xì)胞凍存液和無(wú)血清低DMSO細(xì)胞凍存液,。兩種細(xì)胞凍存液均有無(wú)血清,、無(wú)動(dòng)物源蛋白、非程序降溫的特點(diǎn),，可直接放置-80℃冰箱凍存,。Cellregen無(wú)血清細(xì)胞凍存液已經(jīng)得到了市場(chǎng)廣泛認(rèn)可，用戶遍布全國(guó)科研院所,、大學(xué),、醫(yī)院和企業(yè)。無(wú)血清低DMSO細(xì)胞凍存液是公司新開(kāi)發(fā)的更加低毒,、高效的凍存液產(chǎn)品,，為客戶提供更多選擇。
無(wú)血清細(xì)胞凍存液對(duì)比含血清細(xì)胞凍存液的優(yōu)勢(shì)
附：凍存液對(duì)比表
| 通用細(xì)胞凍存液 | Cellregen 無(wú)血清細(xì)胞凍存液 | 無(wú)血清低 DMSO 細(xì)胞凍存液 |
主要成份 | 含血清,、含 DMSO | 不含血清,，含 DMSO 10% | 不含血清,，低 DMSO 5% |
細(xì)胞毒性 | 高 | 高 | 低 |
安全性 | 低 動(dòng)物來(lái)源病毒、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險(xiǎn)偏高 | 高 無(wú)動(dòng)物來(lái)源病毒,、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險(xiǎn) | 高 無(wú)動(dòng)物來(lái)源病毒,、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險(xiǎn) |
凍存細(xì)胞種類 | 適合含血清細(xì)胞凍存 | 通用型 適合各類細(xì)胞凍存 | 通用型 適合各類細(xì)胞凍存 |
無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) | 易改變易由懸浮狀態(tài)回復(fù)貼壁狀態(tài) | 保持懸浮培養(yǎng)狀態(tài) | 保持懸浮培養(yǎng)狀態(tài) |
批次差異 | 批次差異大 | 無(wú)批次差異 | 無(wú)批次差異 |
操作方法 | 步驟繁瑣 需程序降溫凍存 | 簡(jiǎn)單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 | 簡(jiǎn)單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 |
保存設(shè)備 | 要求高（液氮） | 要求低（ -80℃ 冰箱） | 要求低（ -80℃ 冰箱） |
微量?jī)龃?/span> | 細(xì)胞易死亡，存活率偏低 | 細(xì)胞存活率高 | 細(xì)胞存活率高 |
原位凍存 | 不可行 | 可行,，且方便快捷 如 : 雜交瘤細(xì)胞孔板凍存 | 可行,，且方便快捷 如 : 雜交瘤細(xì)胞孔板凍存 |
注意事項(xiàng)：
◆ 細(xì)胞的復(fù)蘇中，如細(xì)胞對(duì)溫度比較敏感,，可將生長(zhǎng)培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃后再加入融化后的細(xì)胞凍存液中混勻,。
◆ 將復(fù)蘇的細(xì)胞高密度接種，如兩支凍存細(xì)胞接種到一個(gè)孔板中,，可有效提高復(fù)蘇效率,。
◆ 細(xì)胞凍存，在加入凍存液進(jìn)行分裝的過(guò)程中,，要不時(shí)輕輕混合細(xì)胞,，使其保持均勻的細(xì)胞懸液狀態(tài)，更有利于保證細(xì)胞的凍存效果,。
三,、細(xì)胞傳代
貼壁細(xì)胞傳代流程：
1. 當(dāng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80%左右即可細(xì)胞的傳代操作，從培養(yǎng)器皿中吸棄原有的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基,。
2. 使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞（緩沖液用量根據(jù)培養(yǎng)器皿的表面積調(diào)整）,，避免攪動(dòng)細(xì)胞，前后輕晃動(dòng)器皿數(shù)次,。
3. 吸棄緩沖液,，重復(fù)潤(rùn)洗一次。
4. 向培養(yǎng)器皿中加入適量的預(yù)熱解離劑（如胰蛋白酶等）,，充分覆蓋細(xì)胞層,，輕輕晃動(dòng)容器數(shù)次。
5. 將培養(yǎng)器皿在室溫下孵育2-5分鐘,。實(shí)際孵育時(shí)間實(shí)際根據(jù)細(xì)胞系的種類不同而定,。6. 移至倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況，可輕輕拍打器皿壁沿以加快細(xì)胞解離,。
7. 當(dāng)細(xì)胞解離程度大于90%,，加入三倍于解離液體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中止解離過(guò)程，輕輕晃動(dòng)后吹打細(xì)胞,，收集至無(wú)菌離心管中,。
8. 約800-1000rpm下離心5-10min，實(shí)際離心速度時(shí)間取決于細(xì)胞種類和細(xì)胞狀態(tài),。
9. 棄去含解離劑的上清溶液,，用少體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，混勻后取出少量使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)量,。
10. 將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度,，并將適量體積的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中放回培養(yǎng)箱。
懸浮細(xì)胞傳代流程：
1. 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至適合傳代（即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期而未達(dá)到聚合的狀態(tài)）時(shí),，從培養(yǎng)瓶中吸取出少量的細(xì)胞樣品,，如有細(xì)胞已部分沉淀，要先輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞處于均勻的懸浮狀態(tài)后再取樣,。
2. 使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),。
3. 計(jì)算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度所需要的加入的培養(yǎng)基體積，如有必要,，可先對(duì)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞進(jìn)行離心收集（800-1000rpm,、5-10min）后再重懸計(jì)數(shù)和接種。
4. 在無(wú)菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中,，必要時(shí)可將培養(yǎng)的細(xì)胞分散接種到多個(gè)培養(yǎng)瓶中,。
5. 將培養(yǎng)瓶的旋蓋外旋一圈，便于進(jìn)行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋）,，并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。
注意事項(xiàng)：
◆ 貼壁細(xì)胞在進(jìn)行解離（消化）過(guò)程中，如果室溫下效果不理想,，可轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱中加快該過(guò)程,，但要注意控制時(shí)間，每30秒需要鏡檢一次,。
◆ 細(xì)胞在緩沖液潤(rùn)洗過(guò)程中要盡量**,，培養(yǎng)液中的血清殘留會(huì)影響消化效果。
◆ 為了減少細(xì)胞碎片和無(wú)用的代謝副產(chǎn)物在培養(yǎng)液中累積,，每三周或者必要時(shí)都應(yīng)將懸浮細(xì)胞收集起來(lái)進(jìn)行一次離心重懸再接種,，具體操作等同于正常的傳代培養(yǎng)。
◆ 通常情況下,，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中所需添加特定的生長(zhǎng)依賴因子,，盡量按照“現(xiàn)用現(xiàn)添加”的原則，從而保證培養(yǎng)基中該物質(zhì)的濃度足夠滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)需求,。
