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單克隆抗體 N-糖基化的毛細(xì)管電泳和質(zhì) 譜分析
閱讀：372 發(fā)布時間：2025-5-13前言近年來,，單克隆抗體 (mAb) 已成為生物制藥行業(yè)具有潛力的新興蛋白候選藥物,。其藥物研發(fā)流程包括一系列精細(xì)的控制和評估步驟，需要仔細(xì),、嚴(yán)格地監(jiān)測目標(biāo)化合物的治療穩(wěn)定性及有效性,。因此，在商業(yè)化前的每個階段對 mAb 進(jìn)行全面表征是極其有益的,。在大量研究成熟的蛋白翻譯后修飾中,，已知糖基化在很多生物過程中都扮演著重要的角色（例如蛋白降解和轉(zhuǎn)錄），從而影響健康和疾病進(jìn)展1,。而鑒定重要蛋白分子中連接的糖基則需要一種可靠,、穩(wěn)定,、靈敏的分析技術(shù),。近來，毛細(xì)管電泳 (CE) 在糖蛋白分析領(lǐng)域得到了眾多關(guān)注,，主要是由于其可以縮短分析時間,，并保持高效分離。使用一種熒光發(fā)色團(tuán)（ATPS,，陰離子）對酶解所得多糖進(jìn)行標(biāo)記,，CE 分離后，利用高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光 (LIF) 或質(zhì)譜 (MS)進(jìn)行檢測,。APTS 標(biāo)記將負(fù)電荷傳遞給多糖,，可提高電泳分離能力，并使之更適用于電噴霧電離（負(fù)模式）,，使整個分離和檢測過程與熒光標(biāo)記化學(xué)高度兼容,。將CE 與 MS 串聯(lián)有益于鑒定未知的糖基化修飾或質(zhì)量信息，并進(jìn)行峰指認(rèn)2,。本應(yīng)用簡報展示了利用 CE-QTOF MS 對重組 mAb 所得的 N-糖基進(jìn)行分析,。APTS 標(biāo)記的 CE-MS 方法有助于鑒定 mAb 上的所有糖基。此外,，還可得到每種多糖的相對百分比,，以表征主要及次要糖基化修飾。
前言近年來,，單克隆抗體 (mAb) 已成為生物制藥行業(yè)具有潛力的新興蛋白候選藥物,。其藥物研發(fā)流程包括一系列精細(xì)的控制和評估步驟，需要仔細(xì),、嚴(yán)格地監(jiān)測目標(biāo)化合物的治療穩(wěn)定性及有效性,。因此，在商業(yè)化前的每個階段對 mAb 進(jìn)行全面表征是極其有益的,。在大量研究成熟的蛋白翻譯后修飾中,，已知糖基化在很多生物過程中都扮演著重要的角色（例如蛋白降解和轉(zhuǎn)錄）,，從而影響健康和疾病進(jìn)展1。而鑒定重要蛋白分子中連接的糖基則需要一種可靠,、穩(wěn)定,、靈敏的分析技術(shù)。近來,，毛細(xì)管電泳 (CE) 在糖蛋白分析領(lǐng)域得到了眾多關(guān)注,，主要是由于其可以縮短分析時間，并保持高效分離,。使用一種熒光發(fā)色團(tuán)（ATPS,，陰離子）對酶解所得多糖進(jìn)行標(biāo)記，CE 分離后,，利用高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光 (LIF) 或質(zhì)譜 (MS)進(jìn)行檢測,。APTS 標(biāo)記將負(fù)電荷傳遞給多糖，可提高電泳分離能力,，并使之更適用于電噴霧電離（負(fù)模式）,，使整個分離和檢測過程與熒光標(biāo)記化學(xué)高度兼容。將CE 與 MS 串聯(lián)有益于鑒定未知的糖基化修飾或質(zhì)量信息,，并進(jìn)行峰指認(rèn)2,。本應(yīng)用簡報展示了利用 CE-QTOF MS 對重組 mAb 所得的 N-糖基進(jìn)行分析。APTS 標(biāo)記的 CE-MS 方法有助于鑒定 mAb 上的所有糖基,。此外,，還可得到每種多糖的相對百分比，以表征主要及次要糖基化修飾,。
CE-MS 儀器方法CE-ESI-MS 分析中使用 7100 CE 系統(tǒng)（配有CE-MS毛細(xì)管卡套,，部件號 G1603A），串聯(lián) 6520 精確質(zhì)量 Q-TOF（配有雙離子源及正交共軸鞘液接口,，部件號 G1607B）3,。使用空緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化分離條件和噴霧穩(wěn)定性。鞘液 CE-MS 接口處維持一個較低的流速 (5 µL/min) 以保持 CE 分離的高效性,，并為電噴霧電離提供一個穩(wěn)定流及其它必要的噴霧條件,。Q-TOF 參數(shù)由MS 調(diào)諧系統(tǒng)自動優(yōu)化，并利用 ESI 調(diào)諧混合物對 MS 系統(tǒng)進(jìn)行校正,。
表 1 列出了 CE-MS 的參數(shù),。所有化合物列表由 MassHunter 分子特征提取 (MFE)算法提取所得。
結(jié)果與討論盡管 CE-LIF 常用于多糖分析,，但 CE-MS能提供分子量信息,，所以在鑒定電泳結(jié)果中的未知遷移條帶方面具有優(yōu)勢。在本應(yīng)用簡報中,，將 CE 與配有鞘液接口的 Q-TOF MS 串聯(lián),，以指認(rèn) mAb 所得多糖的質(zhì)量信息,。方案 1 描述了 mAb 糖譜的 CE-MS 分析步驟。簡單地說,，抗體釋放的多糖先進(jìn)行 APTS 標(biāo)記,，然后進(jìn)行 CE-MS 分析。圖 1 為重組 mAb 中釋放所得的 N-糖基的 CE-MS 總化合物譜,。利用 PVA 涂層毛細(xì)管,，所有 mAb 多糖均可在 15 分鐘分離時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)遷移。通過重復(fù)實(shí)驗(yàn),，我們成功鑒定了未帶電荷的N-糖基類化合物,，包括 G0、G0F,、G1,、G1F、G2 和 G2F,。此外,，還觀察到了單唾液酸化的多糖 G2F+1NANA,。所有峰的指認(rèn)均基于 Q-TOF 分析測得的精確分子量,。
表 2 總結(jié)了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是,，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類,，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數(shù)據(jù)未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優(yōu)勢（即 CE-MS 的互補(bǔ)價值）,。
表 2 總結(jié)了本研究中鑒定的多糖,。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類,，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數(shù)據(jù)未列出）,，表明基于 CE-MS 的分析有顯著優(yōu)勢（即 CE-MS 的互補(bǔ)價值）。
表 2 總結(jié)了本研究中鑒定的多糖,。需要注意的是,，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數(shù)據(jù)未列出）,，表明基于 CE-MS 的分析有顯著優(yōu)勢（即 CE-MS 的互補(bǔ)價值）,。
很敏感。通過計算相對于總化合物峰容量的百分容量,，可對 mAb 釋放所得的多糖進(jìn)行相對定量,，結(jié)果如表 2 所示。在本例中,，G2+1NANA 是糖型中的主要形式,。
這些結(jié)果清晰地指出 CE-MS 可成為檢測糖譜的一種有效的替代分析工具,。串聯(lián)CE-MS 分離可避免污染，這是因?yàn)闃悠诽幚聿襟E很少,，CE 分離使用的緩沖液與電噴霧電離高度兼容,。與 CE-LIF 相比，該方法在糖譜分析中更為靈敏,、精確,。
結(jié)論本應(yīng)用簡報提供了一個基于 Agilent CE-MS的 mAb糖譜分析方法。Agilent MassHunter和 BioConfirm 軟件包的強(qiáng)大數(shù)據(jù)處理能力能夠成功,、詳盡地鑒定并得出 mAb 糖型譜,。此外，通過分離主要和次要多糖形式,，可合理解析糖基化模式,。