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高效液相色譜儀對(duì)奶粉中?；撬徇M(jìn)行分析
閱讀：357 發(fā)布時(shí)間：2024-12-12前言牛磺酸是一種含硫氨基酸,，廣泛分布于體內(nèi)各個(gè)組織和器官,，且主要以游離狀態(tài)存在于組織間液和細(xì)胞內(nèi)液中，最先于公牛膽汁中發(fā)現(xiàn)而得名,。長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是含硫氨基酸的無功能代謝產(chǎn)物,，后來經(jīng)諸多研究發(fā)現(xiàn)，?；撬崾钦{(diào)節(jié)機(jī)體正常生理活動(dòng)的活性物質(zhì),，且具有多種功能，是人體必需的重要氨基酸,。人乳中?；撬岷亢芨撸侵饕挠坞x型氨基酸,，而牛乳中?；撬岷繀s非常少。因此,，?；撬嵋驯蛔鳛闋I(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加在奶粉及其他各類兒童營(yíng)養(yǎng)食品中，可以促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力的發(fā)育,、提高新陳代謝能力,，對(duì)寶寶的健康發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,，推薦嬰兒配方食品中添加?；撬醄1]。?；撬岬臋z測(cè)方法有很多,，目前常用的方法是柱前或柱后衍生化高效液相色譜法。例如現(xiàn)行國(guó)標(biāo)就是使用鄰苯二甲醛(ortho-phthalaldehyde, OPA) 柱后衍生以及單磺酰氯柱前衍生法[2],。柱后衍生法利用?；撬崤c OPA 在堿性條件下生成相應(yīng)的衍生物，通過用熒光檢測(cè)器來測(cè)定衍生物的含量,，該法具有方法穩(wěn)定,、干擾小、重現(xiàn)性較好及回收率較高等優(yōu)點(diǎn),，但是柱后衍生需要使用離子交換柱,，離子交換柱通用性不好，不同供應(yīng)商色譜柱一致性很差,，安裝了柱后衍生裝置的液相色譜儀器通用性也很差,，且裝置較為昂貴,，所以具有很大的局限性。柱前衍生方法利用單磺酰氯在堿性條件下與?；撬徇M(jìn)行衍生化反應(yīng),，在紫外或熒光條件下測(cè)定牛磺酸的含量,，該法需要人工進(jìn)行復(fù)雜且要求苛刻的衍生操作（衍生劑必須每次臨用前現(xiàn)配,、衍生過程需要避光等），衍生需要的時(shí)間很長(zhǎng)而且衍生物不穩(wěn)定,，需衍生后立即進(jìn)樣分析,，方法的檢測(cè)靈敏度也較低。早期也有使用靈敏度更高,、且衍生反應(yīng)快速的 OPA 作為衍生劑的手動(dòng)柱前衍生的方法[3-4],，但因衍生產(chǎn)物的半衰期比丹磺酰氯的短很多，手動(dòng)衍生因無法嚴(yán)格控制衍生時(shí)間的長(zhǎng)短而重現(xiàn)性很差,，
所以方法的局限性更大,。安捷倫全自動(dòng)氨基酸分析方法[5] 使用 OPA 作為衍生劑在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)完成全自動(dòng)衍生，既克服了 OPA 作為柱前衍生劑的缺點(diǎn),，又保留了 OPA 衍生劑的優(yōu)點(diǎn),，極大地提高了方法的穩(wěn)定性及可靠性。安捷倫公司北京實(shí)驗(yàn)室及一些用戶[6] 借助標(biāo)準(zhǔn)的安捷倫全自動(dòng)氨基酸分析方法[7] 及試劑包并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)化,、利用單磺酰氯衍生方案的樣品前處理步驟及色譜分析條件,，完成了對(duì)牛磺酸的分析,。隨著安捷倫公司對(duì)全自動(dòng)氨基酸分析方法的改進(jìn)[8] 及新色譜柱的出現(xiàn),，對(duì)牛磺酸分析方法的性能有了進(jìn)一步提高的空間,，也需要分析速度更快,、靈敏度更高且更合理的牛磺酸分析方法,。本研究采用的牛磺酸測(cè)定方法是在安捷倫全自動(dòng)氨基酸分析方法[8]及試劑的基礎(chǔ)上,，結(jié)合 OPA 分析?；撬岬奈墨I(xiàn)[3-4] 對(duì)方法進(jìn)行了易用性及合理性的改善。同時(shí),，靈敏度的提高使之僅用紫外檢測(cè)器就可檢出未強(qiáng)化奶粉中?；撬岬谋镜缀俊?/p>
實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品乙腈（迪馬公司）為色譜純,；醋酸銨 (Sigma),、5-磺基水楊酸(CNW) 為優(yōu)級(jí)純,。所用的實(shí)驗(yàn)用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水；?；撬釋?duì)照品及所有樣品均來自安捷倫的客戶,。衍生試劑選用安捷倫氨基酸分析套件中的硼酸緩沖鹽（部件號(hào)5061-3339）及 OPA（部件號(hào) 5061-3335，這是已經(jīng)與 3-巰基丙酸混合并溶于 0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液中,、配制好的 OPA）,。
儀器和設(shè)備采用 Agilent 1220 Infinity 液相色譜儀系統(tǒng)（部件號(hào) G4294B），配備：二元梯度泵（內(nèi)置脫氣機(jī)）,、自動(dòng)進(jìn)樣器,、柱溫箱及 DAD檢測(cè)器?？刂萍皵?shù)據(jù)處理軟件使用 OpenLab Chemstation,，版本C.01.10。色譜柱選用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 50 mm,2.7 μm（部件號(hào) 699975-902）,。標(biāo)樣配制準(zhǔn)確稱取 0.1000 g ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至 100 mL,，得到 1 mg/mL ?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將該?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用水稀釋配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為 0.5、2.0,、5.0,、10.0及 20.0 μg/mL，臨用前現(xiàn)配,。
樣品前處理配制 0.2 mol/L 磺基水楊酸溶液：稱約 5 g 的 5-磺基水楊酸（帶 2分子水）溶于 100 mL 水中,。配制及處理樣品：稱取約 5 g 奶粉溶于 40 mL 熱水（約 40 °C）中，充分搖動(dòng)混勻后靜置,。將該奶粉溶液與 0.2 mol/L 磺基水楊酸溶液 1:1 充分混合（各 5 mL）后靜置 10 分鐘,，靜置后置于高速離心機(jī)，13000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘,。取上清液用 0.2 μm 過濾膜（水溶性）過濾后使用,。加標(biāo)樣品配制前加標(biāo)樣品：溶解奶粉之前，加入 20 μg/mL 標(biāo)樣 5 mL,，剩下步驟與處理樣品一致,。相當(dāng)于在樣品中添加了 1.25 μg/mL 的牛磺酸,。后加標(biāo)樣品：處理好并過濾后的樣品溶液與 20 μg/mL 標(biāo)樣等體積混合,。相當(dāng)于樣品的?；撬釢舛葴p半，再加上 10 μg/mL 的?；撬?。
