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液質(zhì)聯(lián)用儀測定動物源食品中的潮霉素 B
閱讀：379 發(fā)布時間：2024-11-29摘要：本文使用 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取凈化并結合安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀HPLC-MS/MS，建立了一種測定不同動物源食品（豬肉,、豬肝、豬腎,、羊肉,、牛奶、雞蛋）中潮霉素 B 的檢測方法,。在 10–500 ng/L 的濃度范圍內(nèi),，使用同位素內(nèi)標校正所得到的線性相關系數(shù)高于 0.99；各種動物源食品中潮霉素 B 的方法檢測限為 10 μg/kg,，定量限為 20 μg/kg,；在加標濃度為 20–250 ng/g 時，不同目標物的平均加標回收率和相對標準偏差分別在94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內(nèi),。該方法適用于多種動物源食品中潮霉素 B 殘留的測定,。
前言：潮霉素 B 是由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素。其能夠抑制蛋白質(zhì)合成,，從而殺死細菌,、真菌和高等真核細胞，可有效控制豬蛔蟲,、食道口線蟲和毛首線蟲感染（例如,，在妊娠母豬全價飼料中添加潮霉素 B，能夠保護仔豬在哺乳期間不受蛔蟲感染）,，同時對雞蛔蟲,、雞異刺續(xù)蟲和禽封閉毛細線蟲均有良好的控制效應[1]。GB 31650-2019[2] 中規(guī)定潮霉素 B 可用作治療,，但不得在動物性食品（可食組織,、雞蛋）中檢出。因此,，非常有必要建立動物源食品中潮霉素 B 的檢測方法,。GB/T 21323-2007[3] 介紹了一種檢測動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定方法,。該方法使用磷酸-三氯yi酸緩沖液進行提取，并使用離子對試劑七氟丁酸降低氨基糖苷極性,，然后通過 C18 固相萃取柱進行凈化,。但該方法中的七氟丁酸使用量大，成本較高,，且向流動相含有 20% 100 mmol/L 七氟丁酸會對質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染,。本文在該標準的基礎上，對樣品前處理過程進行了改進,。采用yi酸銨-三氯yi酸緩沖溶液進行提取,，并通過具有機理的 Bond Elut PBA 進行固相萃取凈化，其硅膠基體上鍵合的苯硼酸官能團對潮霉素 B 結構中的順式-二醇官能團具有較強的選擇性,，在堿性條件下通過可逆共價鍵被保留,，然后在酸性條件下洗脫，從而實現(xiàn)高選擇性保留和凈化效果,。另外,，該方法使用內(nèi)標法進行定量，僅在上機前定容溶液中加入七氟丁酸,，可避免污染系統(tǒng),。由此建立了一種適用于快速、簡便地檢測多種動物源基質(zhì)中潮霉素 B 的方法,。
實驗部分試劑和樣品實驗用乙腈,、甲酸、七氟丁酸均為色譜純,，購于北京迪馬科技有限公司,；實驗用水為娃哈哈純凈水。潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 標準品：100 μg/mL（BePure,，購于曼哈格公司,，以水為溶劑）?；|(zhì)樣品為市售產(chǎn)品,。儀器和設備采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜/6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS/MS) 系統(tǒng)；Agilent Vac Elut 20 位固相萃取裝置,。所用其他主要設備包括 3K-15 離心機（德國 Sigma 公司）和渦旋混勻器（德國 IKA 公司）,。色譜柱采用 Agilent Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm（部件號 695975-306）。樣品前處理采用 Agilent Bond Elut PBA（100 mg,，3 mL,，部件號 12102127）、Agilent ValueLab PES 微孔濾膜（0.2 μm，13 mm,，部件號 5190-5273）,、安捷倫陶瓷均質(zhì)子（用于 50 mL離心管，部件號 5982-9313）,。溶劑和標樣配制分別取適量的標準品用乙腈:水 (50:50, V/V) 配制濃度為 10 mg/L的潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 內(nèi)標標準工作液,，逐級稀釋備用。校準標樣的配制：分別準確移取上述適量標準工作液,，用 0.5%甲酸水（含 1% 七氟丁酸）稀釋成濃度分別為 10,、20、50,、100,、200、500 和 1000 μg/L 的標準溶液,，其中內(nèi)標濃度為50 μg/L,，現(xiàn)配現(xiàn)用。 然后向其中加入 50 g 三氯yi酸,，溶解并混勻后,，加水定容至 1000 mL，搖勻后備用（在 4 °C下可保存 1 個月）,。
樣品前處理稱取樣品 5 g (±0.05 g) 于 50 mL 離心管中，添加一定量的內(nèi)標,；加入陶瓷均質(zhì)子,，向其中準確加入 5 mL 銨-三氯yi酸緩沖溶液，渦旋振蕩 5 min,；以 8000 r/min 離心 5 min,，將上清液全部轉移至15 mL 離心管中；將剩余殘渣用 5 復提取一次,，以 8000 r/min 離心 5 min 后合并上清液,； pH = 8.5 (±0.2)，定容至 12 mL（將牛奶定容至 15 mL）,；然后以 8000 r/min 離心 5 min,，所得上清液用作備用液。將 Bond Elut PBA 固相萃取柱依次用 2 mL 乙腈,、3 mL 0.5% 甲酸水,、5 mL 0.2 mol/L (pH = 8.5) 活化；取一半體積的備用液 (6 mL) 過柱（對于牛奶,，則取 7.5 mL）,；待樣品液全部流出之后，依次用 3 mL 0.2 mol/L (pH = 8.5) 和 3 mL 水淋洗，并抽干 2 min,；加 2 mL 0.5% 甲酸水分兩次洗脫,；向洗脫液中加入 20 μL 七氟丁酸，渦旋混勻后,，過 0.2 μm PES 濾膜,，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，前處理流程圖見圖 1,。
液相色譜條件儀器 Agilent 1290 Infinity II 高速泵（部件號 G7120A）Agilent 1290 Infinity II 進樣器（部件號 G7167B）Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱（部件號G7116B）色譜柱 Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm流動相 A：0.5 mmol/L 乙酸銨,，0.1% 甲酸水溶液B：乙腈流速 0.3 mL/min梯度 時間 (min) B (%)0 22.0 22.1 85.1 407.0 908.0 90后運行時間 3 min柱溫 40 °C進樣體積 10 μL
檢測限和定量限通過空白基質(zhì)中的加標回收試驗來確定方法的檢測限和定量限。當加標濃度為 10 µg/kg 時仍可定性檢出,，目標物色譜峰的信噪比(S/N) 大于 3,，由此確定該方法的檢測限為 10 µg/kg；當加標濃度為 20 µg/kg 時,，信噪比 (S/N) 大于 10,，且回收率和重現(xiàn)性均能滿足相關國家標準要求，由此確定該方法的定量限為 20 μg/kg,?；厥章屎途芏缺緫眠x擇幾種代表性的動物源食品，即豬肉,、豬肝,、豬腎、羊肉,、牛奶和雞蛋,，分別添加 20、50,、250 μg/kg 三個濃度樣品,，且每個加標水平設六個平行樣，以此驗證方法的準確度和精密度,，結果見表 2,。潮霉素 B 在不同動物源食品中的平均回收率和相對標準偏差分別在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準確度和精密度,。不同動物源食品中基質(zhì)空白和潮霉素加標回收色譜圖見圖 3,。
結論本文采用 HPLC-MS/MS 結合 Poroshell 120 EC-C8 色譜柱建立了一種檢測動物源食品中潮霉素 B 的方法。該方法與 GB/T 21323-2007 相比,，在上機前溶液中加入七氟丁酸,，可大幅減少七氟丁酸的使用量并避免了離子對試劑對儀器的污染。同時,，采用共價機理的 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取柱對潮霉素 B 具有高選擇性,，可實現(xiàn)出色的凈化效果,。該方法簡便、高效,，在 10–500 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性（線性相關系數(shù) R2 高于 0.99）,；且靈敏度出色（檢測限為 10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg）,；不同動物源樣品基質(zhì)中潮霉素 B 的平均加標回收率和相對標準偏差分別在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內(nèi),，表明其具有良好的準確度和精密度。該方法適用于測定多種動物源食品中的潮霉素 B 殘留,。