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采用在線固相萃取-液相色譜法快速測定食品中 β-胡蘿卜素的含量
閱讀：210 發(fā)布時間：2024-11-25摘要本應(yīng)用簡報介紹了一種快速測定食品中 β-胡蘿卜素的在線固相萃取-液相色譜分析方法。該方法以 C8 色譜柱作為分析柱,，樣品經(jīng)皂化后直接進(jìn)樣，系統(tǒng)自動完成目標(biāo)化合物的富集,、凈化和分離等過程,。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了影響色譜分析的關(guān)鍵參數(shù)，并對方法學(xué)性能進(jìn)行了系統(tǒng)考察,。結(jié)果表明,，該方法滿足測定要求及現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法要求,，并且具有簡便、快速,、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),，尤其適用于樣品檢測需求較高的實(shí)驗(yàn)室中。
前言β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一,，是維生素 A 的前體,。它大量存在于植物中，是自然界中普遍存在且穩(wěn)定的天然色素,。與其他類胡蘿卜素一樣,，β-胡蘿卜素是一種抗氧化物，具有清除自由基的能力,；作為維生素 A 的前體,，β-胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化成維生素 A，是安全補(bǔ)充維生素 A 的產(chǎn)品,，有助于維持眼睛和皮膚的健康,、改善夜盲癥、皮膚粗糙狀況等,，有很高的藥理學(xué)及營養(yǎng)學(xué)價值,。其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品,、食品添加劑及化妝品等行業(yè),，并且作為食品添加劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑和醫(yī)藥制劑使用,。GB5009.83-2016規(guī)定的食品中 β-胡蘿卜素的測定方法通常包括皂化,、石油醚的液-液萃取、旋蒸,、氮吹和定容等樣品前處理過程,，儀器方法分析時間近 40 min[1]。整個分析過程繁瑣,、耗時,，且 β-胡蘿卜素易被氧化，方法回收率和重現(xiàn)性難以保證,。本文采用在線固相萃取-液相色譜法,，將樣品皂化后直接上機(jī)分析，能夠快速測定其中的 β-胡蘿卜素含量,。
實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品抗壞血酸 (VC, C6H6O6),、氫氧化鉀 (KOH)、2,6-二叔丁基-4-甲ji苯酚 (BHT) 和乙醇均為 HPLC 級,，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司,；甲醇和乙腈均為 HPLC 級，購自 Merck,；甲基叔丁基醚 (MTBE)為 HPLC 級,，購自 Tedia；β-胡蘿卜素（純度 99.9%）購自 LGC公司,；奶粉,、液態(tài)奶購自超市。儀器和設(shè)備采用安捷倫在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng),，配備如下安捷倫模塊：Agilent1260InfinityII四元泵（部件號G7111B×2）,、Agilent1260InfinityII自動進(jìn)樣器（部件號G7129A）、Agilent 1260InfinityII柱溫箱（部件號G7116A,，內(nèi)置2位6通閥）和 Agilent1260InfinityIIDAD（部件號G7117C,，配備60mm超高靈敏度流通池）。軟件采用AgilentOpenLabCDS2.6,。
標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液制備取 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品適量,，置于100mL棕色容量瓶中；向其中加入0.1gBHT,，用二氯甲烷溶解并定容至刻度,，制得 β-胡蘿卜素濃度為0.1049mg/mL的儲備溶液。將其避光儲存于–20°C下,，有效期為1個月,，臨用前使溶液回溫至20°C。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備取標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液適量,，加乙醇（含0.5gVC/L）稀釋25倍,，制得濃度為4.196µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間液；然后取該中間液適量,，用 70% 乙醇（含0.5gVC/L）稀釋得到濃度為0.2098µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液,。樣品前處理取奶粉1.0g、液態(tài)奶 5 g,，參照GB5009.83-2016的樣品前處理方法,，將奶粉先用10mL溫水混勻，然后向其中分別加入1g抗壞血酸,、45 mL 乙醇（含0.1gBHT）和15mL氫氧化鉀溶液(1g/mL),；搖勻后置于53±2°C的水浴鍋中；皂化 30 min 后取出,，迅速冷卻到室溫,；再加入 70% 乙醇（含0.4g/LVC），定容至100mL,；然后在常溫下離心,，取上清液進(jìn)樣分析,。
結(jié)果與討論標(biāo)準(zhǔn)品和典型樣品分離結(jié)果按照上述方法得到的色譜圖如圖2所示。樣品中目標(biāo)峰的分離不受基質(zhì)成分干擾,，便于對 β-胡蘿卜素的總量進(jìn)行測定,。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在樣品溶液制備過程中,，目標(biāo)化合物容易氧化,，因此在皂化過程中加入 BHT，并用含有 VC 的 70% 乙醇溶液進(jìn)行定容,，以盡可能減少全反式 β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化,。
線性關(guān)系和定量限取標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，分別進(jìn)樣 0.5,、2,、5、10,、20,、50 和100µL，以標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),，峰面積為縱坐標(biāo),，考察方法線性。結(jié)果如圖 3 顯示,，β-胡蘿卜素的線性方程為y=46.788x+1.9593,，相關(guān)系數(shù) (R2) > 0.9999，表明 β-胡蘿卜素在0.1049–20.98ng范圍內(nèi),，獲得了良好的線性關(guān)系,；按照S/N=10計算，儀器的定量限(LOQ) 為 0.07 ng,，當(dāng)稱樣量為1g時,，進(jìn)樣體積為100µL時，方法的定量限為0.07µg/g,，優(yōu)于現(xiàn)行國標(biāo)方法[1],。
方法精度取濃度為0.2098µg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 5 次,，進(jìn)樣體積為100µL,，計算目標(biāo)峰的峰面積和保留時間的RSD。計算得出,，β-胡蘿卜素的保留時間RSD為0.02%,，峰面積RSD為0.69%，表明該方法具有良好的精密度。
方法準(zhǔn)確度分別取空白溶劑（70% 乙醇）,、奶粉和液態(tài)奶樣品,，按照高、中,、低三個水平加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液,，并按照樣品溶液制備方法,，制得待測溶液并上機(jī)分析,；然后確定目標(biāo)物的總量，并計算加標(biāo)回收率,。結(jié)果見表2,。從表中可以看出，β-胡蘿卜素的高,、中,、低三水平加標(biāo)的平均回收率為101.98%，表明該方法整體測定結(jié)果的準(zhǔn)確度良好,。
結(jié)論本應(yīng)用基于在線固相萃取技術(shù)初步建立了一種快速分析食品中 β-胡蘿卜素含量的方法,。其中樣品經(jīng)皂化后可直接上機(jī)分析，系統(tǒng)將自動完成目標(biāo)物的凈化,、富集和分析全過程,。該方法大幅簡化了樣品前處理過程，并提高了樣品分析效率,。初步方法學(xué)評估結(jié)果表明,，該方法的線性、靈敏度,、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足目標(biāo)化合物的定量要求,，適用于測定實(shí)際樣品中 β-胡蘿卜素的含量。