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使用二維液相色譜分析飼料中的 維生素 A,、D3,、E
閱讀：245 發(fā)布時間：2024-11-15摘要本文介紹了使用二維液相色譜同時檢測飼料中維生素 A,、D3,、E 的分析方法。前處理使用安捷倫表面親水反相苯乙烯二乙烯基苯聚合物 Bond Elut Plexa 對飼料堿性皂化液進行富集和凈化,，方法簡單,，高效、環(huán)保,。在相應的濃度范圍內(nèi),，維生素 A、D3、E 的線性相關系數(shù)均大于 0.999,。5 種飼料在不同的加標濃度下,，維生素 A、D3,、E 的平均加標回收率分別在 91.9%–112.1%,、87.4%–122.9% 和 89.4%–116.7% 之間，相對標準偏差分別在1.0%–11.5%,、0.2%–10.5% 和 0.9%–9% 之間,，準確度和精密度良好，該方法適用于同時檢測飼料中的維生素 A,、D3,、E。
前言脂溶性維生素 A,、D,、E 作為一類有機微量營養(yǎng)物質，有促進動物生長,、調(diào)節(jié)代謝和增強動物免疫等作用,。通常情況下，畜禽不能或難以合成滿足自身需要的足量維生素,，因此需要在飼料中添加適量維生素,，以滿足養(yǎng)殖業(yè)對于飼喂畜禽快速、健康生長的需求[1],。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 2625 號公告[2] 制定了飼料中維生素的推薦用量和最高用以指導飼料生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)畜禽品種和不同生長階段調(diào)控維生素的添加量,。根據(jù)現(xiàn)行的國家標準，維生素 A,、D3,、E 的檢測是分開的三個標準[3-5]，檢測成本較高,，耗時且工作量大,。因此，有必要建立一種可以同時檢測維生素A,、D3,、E 的方法，實現(xiàn)飼料中脂溶性維生素含量的準確測定,，對飼料中維生素含量進行監(jiān)控,，掌控飼料中含量，使其可以既滿足畜禽營養(yǎng)需求,，又符合國家規(guī)范要求,。飼料中維生素 A,、D3、E 的前處理方法,，通常包括皂化,、提取和濃縮等步驟，皂化的主要目的是將維生素從制劑包被的狀態(tài)中游離出來同時將酯形式的維生素水解為醇便于檢測,，皂化步驟通常是一步,。對于提取和濃縮，一般有液液萃取和固相萃取兩種方法,，傳統(tǒng)的液液萃取方式采用石油醚,，相比于液液萃取消耗溶劑量大，環(huán)境不友好,，耗時的缺陷而言,，固相萃取具有節(jié)省溶劑，集凈化和濃縮于一體且能實現(xiàn)良好的凈化效果等優(yōu)勢,。Agilent Bond Elut Plexa SPE 柱,，是表面羥基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，易被水潤濕且流速優(yōu)異,，可耐受高pH,，是比較理想的選擇。對于儀器方法,，維生素 A,、E 可使用一維 DAD 檢測，而維生素 D3 添加量較低,，靈敏度有限且易受基質干擾，是制約維生素 A,、D3,、E 同時檢測的難點所在。二維液相色譜具有自動化程度高且峰容量大,，可顯著降低復雜樣品的基質干擾等特點,，已得到廣泛的應用，安捷倫目前已經(jīng)有多篇關于食品中維生素 A,、D,、E 同時檢測的應用[6-9]，其中包括在線 SPE-2D中心切割法對皂化液進行自動凈化,，富集,，以及維生素 A、D,、E 的同時分析,。本文在此基礎上，使用 Agilent Bond Elut Plexa離線固相萃取方式對皂化液進行凈化和富集,，并結合二維液相色譜,，建立了同時檢測飼料中三種脂溶性維生素 A、D3,、E 含量的方法,，為用戶提供更多，更靈活的方法選擇,。
實驗部分試劑和樣品實驗用乙腈,、甲醇均為色譜純，購于北京迪馬科技有限公司,；無水乙醇,、氫氧化鉀、L-抗壞血酸,、二丁基羥基甲苯 (BHT) 為分析純,。維生素 A、維生素 A 乙酸酯,、維生素 E,、維生素 E 乙酸酯和維生素 D3 標準品購于曼哈格公司 (BePure)。飼料樣品為市售產(chǎn)品,。標準品制備稱取一定量上述標準品,，以甲醇為溶劑，配制于棕色試劑瓶中,，密封后避光儲存于 –18 °C 下。臨用前將儲備溶液回溫至室溫,，參考國標方法進行濃度校正,。
儀器和設備儀器具體配置如下：Agilent 1260 Infinity II 泵（第一維泵，部件號 G7111,；第二維泵，部件號 G1312B）,；Agilent 1260 InfinityII 自動進樣器（部件號 G7129A）；Agilent 1260 Infinity II 柱溫箱（部件號 G7116A）,； Agilent 1260 Infinity II VWD（部件號G7114B，第一維檢測器）Agilent 1260 Infinity II DAD 檢測器（G7117C,，第二維檢測器）,。色譜柱采用 Agilent Poroshell HPH-C8（4.6 × 50 mm, 2.7 µm,，部件號 699975-706）,、Poroshell 120 EC-C18（4.6 × 5 mm, 2.7 µm,，部件號 820750-911）和 Zorbax Eclipse PAH（2.1 × 100 mm,3.5 μm ，部件號959793-918）,。樣品前處理采用 Agilent Bond Elut Plexa（200 mg，6 mL,；部件號12109206）,、Agilent ValueLab 尼龍微孔濾膜（0.2 μm，13 mm,；部件號 5191-4286）,。
維生素標樣制備準確取適量維生素 A、D3,、E 標準工作液,，用乙腈配制系列標準溶液，其中維生素 A 的濃度分別為 0.2,、0.5,、1、5,、10,、20、50 IU/mL,，維生素 D3 的濃度分別為 0.1,、0.5、1,、5,、10、50 IU/mL,，維生素 E 的濃度分別為 0.0005、0.001,、0.005,、0.05、0.1,、0.2、0.5 IU/mL,，臨用現(xiàn)配,。
樣品前處理稱取一定量飼料樣品,，加入乙醇和氫氧化鉀溶液皂化后使用Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱對皂化液中維生素 A、D3,、E進行富集和凈化,，用二維液相色譜測定，如圖 1 所示為樣品前處理操作流程,，表 1 所示為液相色譜分析條件,。
結果與討論Bond Elut Plexa 固相萃取條件優(yōu)化Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱，是表面羥基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料,，能夠耐受皂化液的強堿條件,，易被水潤濕且流速佳，適合飼料皂化液中富集和凈化維生素 A,、D3,、E。為了確定最佳的固相萃取條件,，本應用從淋洗溶劑（5%,、10%、20%,、40%,、50% 甲醇水）、洗脫溶劑（乙腈,、甲醇,、乙酸乙酯）和洗脫體積（2 mL、3 mL,、4 mL）三個方面對固相萃取條件進行優(yōu)化,。采用飼料皂化液加入適量的維生素 A、D3,、E 標樣的方法,，分別采用上述不同的淋洗溶劑、洗脫溶劑和洗脫體積做相應的處理（在確定最佳的條件之前,，均使用 10% 甲醇水淋洗和4 mL 乙腈洗脫的條件）,，結果分別見圖 2A、2B,。由圖可知,，使用不同的淋洗溶劑，回收率結果沒有明顯差異,，但考慮到上樣皂化液中含有高濃度的氫氧化鉀溶液,，采用高比例水淋洗有更佳的去除效果，因此選擇 10% 甲醇水溶液作為淋洗溶液,。對于不同的洗脫溶劑,，乙腈對維生素 A,、D3、E 的洗脫效果優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯,。因此進一步比較確定了乙腈的使用量,，使用 3 mL 即可將維生素 A、D3,、E 洗脫,，最終確定了使用 10% 甲醇水淋洗，并使用 3 mL 乙腈洗脫,。