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Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計用于蛋白質分析的優(yōu)勢
閱讀：1331 發(fā)布時間：2021-9-23前言：紫外-可見分光光度計測量為樣品的質量控制檢查提供了一種快速可靠的方法,。它們 還可用于計算比活性或估算純化后的產率,，并鑒定含有蛋白質和氨基酸的組分。 含有芳香側鏈氨基酸的蛋白質,，在接近 280 nm 處產生吸收,。因此可以使用紫外-可 見分光光度計進行定量分析。當吸收系數(shù)已知時,，可根據比爾-朗伯定律 (1) 確定含 有這些氨基酸的蛋白質的濃度,。通常蛋白質的樣品量有限，以最少體積進行測量對 于樣品的保存至關重要,。通過波長掃描可提供潛在污染物的信息,。 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計具有光學準直的集成式多池支架，與超微 量比色皿（圖 1）配合使用,，非常適用于可靠且可重現(xiàn)的定性及定量測量,。
本研究展示了Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計在小體 積蛋白質樣品定性和定量分析方面的優(yōu)勢。牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 是常用的蛋白質標準品,，其吸收 系數(shù)已知,，我們將其用于本分析中。
實驗部分 樣品 配制 pH 7.0 的 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液 (PBS),。配制 10 mg/mL BSA 儲備液,，并稀釋至 0.75、1.50,、2.25,、3.00 和 3.75 mg/mL。 使用六個孔徑為 2 × 2.5 mm,，容積 70 µL,，光程 10 mm 的超 微量比色皿進行測量（圖 1）。其中,，一個作為參比,，五個作 為樣品。使用 3.5 mL,、10 mm 光程的標準石英比色皿進行重 現(xiàn)性測量,。采用 PBS 緩沖液作為參比溶液,。 儀器和方法 所有測量均使用 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計。在 250–350 nm 范圍內進行波長掃描,，信號采集平均時間為 1 秒,， 數(shù)據間隔為 1 nm。無需預先校準系統(tǒng),。為證明重現(xiàn)性,，用超微量比色皿 (70 µL) 重復測量 3.0 mg/mL BSA 溶液 20 次，其中參比位置為裝有 PBS 緩沖液的相同超微 量比色皿,。此外,，使用 3.5 mL、10 mm 光程的標準石英比色 皿對同樣的溶液進行另外 20 次重復測量,，以裝有 PBS 緩沖液 的相同比色皿作為參比,。這些測量均在 278 nm 處進行，信號 采集平均時間為 1 秒,，光譜帶寬為 2 nm,。
結果 同步測量 空白樣品和五種濃度 BSA 樣品在 Cary 3500 多池紫外-可見 分光光度計中使用超微量比色皿（2 × 2.5 mm 孔，10 mm 光 程）進行同步測量,。在 250–350 nm 范圍內進行波長掃描以 定性分析樣品（圖 2）,。然后將這些數(shù)據用于評估儀器的線性 （參見下文微量池部分中的線性）。
蛋白質純度 350 nm 處的吸收強度可用于定量和校正存在于蛋白質樣品中 的任何污染物,。從圖 2 可以看出,，該測量樣品在 350 nm 處的 吸光度為 0 Abs。因此,，這些樣品中 BSA 的濃度與光譜圖的峰 最大值成正比,，根據這一關系可準確測定 BSA 的濃度。無需 雜質校正,。 微量池線性 很明顯，每個 BSA 波長掃描的峰最大值均出現(xiàn)在 278 nm 處 （圖 2）,。使用 Cary 紫外工作站軟件提取每個樣品在 278 nm 處峰的吸收強度,，并將其對每種所測樣品中的蛋白質濃度作圖 （圖 3）。這些數(shù)據清晰地展示了 Cary 3500 系統(tǒng)的線性 （圖 3）,。結果表明,，線性范圍擴展至接近 2.5 Abs，即使使用 小孔超微量比色皿也是如此,。
重現(xiàn)性 為證明重現(xiàn)性,，在 70 µL、2 × 2.5 mm 孔徑的超微量比色皿或 3.5 mL 標準比色皿中重復測量 3.0 mg/mL BSA 樣品 20 次,。 兩種比色皿的光程均為 10 mm,。超微量比色皿較小的窗口孔 徑尺寸對測量的重現(xiàn)性（標準偏差）無影響,，如圖 4 所示。 70 µL 超微量比色皿的測量標準偏差為 0.00042,，3.5 mL 標準 比色皿為 0.00029,。使用超微量比色皿測得的吸光度平均值為1.863 Abs。使用 3.5 mL 標準比色皿測得的吸光度平均值為 1.858 Abs,。兩種比色皿所得結果的差異在儀器的測量不確定 度范圍內,。
使用小體積比色皿的風險在于較小的比色皿窗口（通常為比色 皿設計的一部分）孔徑導致光通量減小。光通量減少會使線性 吸光度范圍和測量重現(xiàn)性降低,。Cary 3500 具有高度聚焦的光 束,，可確保以最大光通量通過樣品，且重現(xiàn)性與 3.5 mL 標準 比色皿相同（圖 4）,。
討論 如果已知吸收系數(shù),，可通過紫外-可見光譜圖上的最大吸收強 度進行定量測量。如此處測量的 BSA 樣品,，其吸收系數(shù)已 知,。如果吸收系數(shù)未知，則必須通過測量多個標準品建立校準 曲線,，并根據校準曲線的斜率計算吸收系數(shù),。這是一個耗時的 過程，并可能引起在實驗結束前都無法確定的測量誤差,。 分析人員可以選擇在分析序列中加入已知濃度的樣品來提高數(shù) 據的可靠性,。這些加入的樣品充當內部對照。這種測量方法的 問題在于不能同時測量樣品和標準品,，因而在樣品和標準品測 量之間各種變量可能發(fā)生改變,。如本文所述（圖 2），同步進 行樣品和標樣測試可大大減小其他環(huán)境變量或可能影響樣品前 處理的偏差,。在測量可能不穩(wěn)定的樣品時,，一次測量一個樣品的方法可能會 導致結果錯誤。將樣品置于實驗臺等待測量的過程中,，它們的 吸光度可能會發(fā)生改變,。引起這一改變的原因可能為溫度變 化、照射到溶液的光線的影響或溶液中的化學變化,。這可能導 致定量測量時出現(xiàn)系統(tǒng)誤差,。通過同步測量所有比色皿位置， Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計可消除這些不利變量,，并 提高所生成結果的可靠性,。同時，還可顯著節(jié)省測量時間。
結論 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計為蛋白質的定性和定量分 析帶來了新的可能,。該系統(tǒng)采用*的非移動式整體多池支 架,，專為提高分析效率和重現(xiàn)性而設計。通過同步測量八個比 色皿位置,，可有效減少任何可能在后續(xù)測量過程中出現(xiàn)的不利 變量,。這些特點共同造就了一個強大的分析型紫外-可見分光 光度計系統(tǒng)。
參考文獻 1. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fasman, D.G., Ed. (1992). CRC Press, Boston