化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
Agilent 1290生物液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行高分離度 SEC 分析
閱讀：1024 發(fā)布時間：2021-8-24摘要：本應(yīng)用簡報介紹了配備 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱和超低擴(kuò)散毛細(xì)管的 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)通過體積排阻色譜 (SEC) 分離蛋白質(zhì)的出色分離 度,。生物兼容性 UHPLC 系統(tǒng)能夠使用腐蝕性鹽緩沖液進(jìn)行分析,，因此節(jié)省了維護(hù) 費(fèi)用。比較了不同內(nèi)徑毛細(xì)管（0.17,、0.12 和 0.07 mm）在 SEC 分析中的分離度,。 對一種蛋白質(zhì)混標(biāo)和單克隆抗體 (mAbs)（包括聚集體）進(jìn)行了分離，并比較了分離 度,。此外,，由單一軟件解決方案中的 Agilent OpenLab GPC/SEC 附加軟件確定了分 子量,，實(shí)現(xiàn)了一步式工作流程。
前言：mAbs 等現(xiàn)代生物藥物是高度異質(zhì)性的化 合物,。聚集體是最重要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQAs) 之一,，通常采用 SEC 進(jìn)行監(jiān)測。 這項(xiàng)技術(shù)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算待測物分子 量,，從而對化合物進(jìn)行鑒定,。此外，該技 術(shù)還可通過顯示更高分子量的聚集體成分 （如二聚體和更高程度聚集體）來確認(rèn)純 度,。為獲得足夠的分離度,，推薦使用亞 2 µm 顆粒填充的現(xiàn)代 SEC 色譜柱。為 實(shí)現(xiàn)最佳性能,，亞 2 µm 色譜柱和死 體積盡可能小的 UHPLC 儀器,。死體積過 大會因擴(kuò)散效應(yīng)而損失這些色譜柱獲得 的分離度。此外,，*生物兼容的 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)可以應(yīng)對 SEC 緩沖液中常用的高濃度鹽,，以維護(hù)成本提供可靠結(jié)果。 本應(yīng)用簡報介紹了現(xiàn)代亞 2 µm SEC 色譜 柱在 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)上 的應(yīng)用,，展示了使用死體積極小的儀器帶 來的優(yōu)勢,。為證明死體積對蛋白質(zhì)和聚集 體分離的影響，使用了不同內(nèi)徑的毛細(xì) 管,。將特征明確的 NISTmAb 通過 pH 誘 導(dǎo)和熱誘導(dǎo)產(chǎn)
實(shí)驗(yàn)部分 儀器 • Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A) • Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A),，配備集成 式樣品恒溫箱（選件 #101） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B)，配備生物兼容性熱交換器 • Agilent 1290 Infinity II 可變波長檢測器 (G7114B),，配備生物兼容性微量流通 池,，3 mm,，2 µL 其他部件 Agilent 1290 Infinity II 生物超低擴(kuò)散工具 包 (G7132A#006) 軟件 Agilent OpenLab 2.5 版和 GPC/SEC 附加 軟件 1.2 版
色譜柱 Agilent AdvanceBio SEC 200 ?, 4.6 × 300 mm, 1.9 µm （部件號 PL1580-5201） 樣品 • 校準(zhǔn)用蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號 5190- 9417）：甲狀腺球蛋白 (670000 Da),、 γ-球蛋白 (150000 Da)、卵清蛋白 (45000 Da),、肌紅蛋白 (17000 Da),、 血管緊張素 II (1000 Da) • 人源化單克隆抗體 (mAb) 曲妥珠單 抗（商品名為赫賽汀）購自 Roche (Basel, Switzerland),。曲妥珠單抗溶于 30 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中,，pH 6.8 • Agilent NISTmAb，人源化 IgG1κ mAb （部件號 5191-5745）
pH 誘導(dǎo)/溫度誘導(dǎo) NISTmAb 方案 使用流動相將 mAb 稀釋至 2 mg/mL 的最 終濃度,。pH 誘導(dǎo)方法與其他文獻(xiàn)所述基 本相同,，僅有略微改動[1]：將 1 mol/L HCl 溶液緩緩滴加到樣品溶液中，使其 pH 值 從 6.0 改變?yōu)?1.0,。然后,，滴加 1 mol/L NaOH 溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 10.0,。最后， 再次滴加 1 mol/L HCl 溶液將 pH 值調(diào)回 6.0,。pH 值變化間大約有 1 分鐘的等待時 間,，期間持續(xù)緩慢攪拌溶液。將所得溶液 在 60 °C 下溫育 60 分鐘,。 溶劑和化學(xué)品 • PBS：在 25 °C 下將 1 片 PBS 片溶于 200 mL 去離子水,，得到 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液、0.0027 mol/L 氯hua鉀,、0.137 mol/L 氯化鈉,，pH 7.4 • 化學(xué)品購自德國 VWR 公司 • 新制超純水產(chǎn)自配置 LC-Pak Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)
結(jié)果與討論 用于蛋白質(zhì) SEC 分離的現(xiàn)代色譜柱中填 充亞 2 µm 顆粒，可實(shí)現(xiàn)最佳分離,。而這 需要儀器具有優(yōu)化的低死體積,，因?yàn)楦咚?體積特別是內(nèi)徑較大的毛細(xì)管會損失獲得 的分離度。1290 Infinity II 生物液相色譜 系統(tǒng)對 5 種蛋白質(zhì)混標(biāo)（包括 3 種二聚 體）的分離結(jié)果如圖 1A 所示,。為了降低死體積和擴(kuò)散效應(yīng),，我們使用了 內(nèi)徑 0.07 mm 的毛細(xì)管進(jìn)行分離。早洗 脫的甲狀腺球蛋白二聚體 (4.947 min) 實(shí) 現(xiàn)了部分分離,。如需設(shè)置用于分子量測定 的校準(zhǔn),，使用該混合物中的所有蛋白質(zhì)生 成校準(zhǔn)曲線（圖 1B）。獲得了四階最佳曲 線擬合,。
