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使用Agilent Cary 3500測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化活性濃度
閱讀：965 發(fā)布時(shí)間：2021-7-13前言：酶催化活性濃度測(cè)量是醫(yī)學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)檢測(cè)項(xiàng)目,。目前，國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委 員會(huì) (JCTLM) 已批準(zhǔn)由國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟 (IFCC) 編寫(xiě)的七種酶（L-丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT),、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST),、乳酸脫氫酶 (LDH)、α-淀粉酶 (AMY),、 肌酸激酶 (CK),、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (GGT) 和堿性磷酸酶 (ALP)）的參考方法，即《IFCC 在 37 °C 酶催化活性濃度測(cè)量的原級(jí)參考方法》,。 本研究參照《IFCC 在 37 °C 酶催化活性濃度測(cè)量的原級(jí)參考方法 第 4 部分：丙氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶催化濃度測(cè)定參考方法》[1],，使用 Agilent Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT) 的催化活性濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。該方法中的基本原理是：在 37 °C 的恒溫 條件下,，L-丙氨酸與 2-酮戊二酸在 ALT 的催化下生成丙酮酸和 L-谷氨酸,，丙酮酸與煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸和 NAD+ （如以下反應(yīng)方程式所 示）；然后通過(guò)監(jiān)測(cè) 339 nm 下 NADH 的氧化速率（即吸光度的下降速率）來(lái)測(cè)定丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶的催化活性濃度,，二者呈正比關(guān)系,。 L-丙氨酸 + 2-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 + L-谷氨酸 丙酮酸 + NADH + H+ LD 乳酸 + NAD+
丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化活性濃度測(cè)量 本研究采用配備八池四溫區(qū)控溫附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè) 試，儀器的精準(zhǔn)控溫功能可以保證每個(gè)池位中樣品的溫度均可以滿足 IFCC 規(guī)定的 37.0 ± 0.1 °C 的控溫要求,。實(shí)驗(yàn)樣品采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW(E)090282a,、GBW(E)090283a 以 及 IFCC 組織的 2020 年度參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃 (RELA) A、B 樣本,。
基本操作流程如下： 1) 確認(rèn)測(cè)量條件合格（儀器,、試劑和環(huán)境條件） 2) 打開(kāi)分光光度計(jì)及輔助設(shè)備 3) 監(jiān)測(cè)比色杯內(nèi)溫度達(dá) 37.0 ± 0.1 °C 4) 準(zhǔn)備試劑和分析溶液，并孵育反應(yīng)液試劑達(dá) 37 °C 5) 在比色杯內(nèi)加入 2 mL 反應(yīng)液和 0.2 mL 分析溶液,，充分混勻 6) 孵育 5 分鐘達(dá) 37 °C,，加入 0.2 mL 起始反應(yīng)液，充分混勻,，并 延遲 90 s 7) 監(jiān)測(cè)吸光度讀數(shù) 180 s 在正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW(E)090282a 和 GBW(E)090283a，每份樣本檢測(cè) 3 次,，計(jì)算均值,，比較其是否在 標(biāo)物的靶值 ± 不確定度范圍內(nèi)；檢測(cè) IFCC 組織的 2020 年 RELA 樣本 A 和 B,，每份樣本檢測(cè) 3 次,，計(jì)算均值是否在其等效限內(nèi)。 結(jié)果均列于表 1 中,。從中可以看出,，所得結(jié)果均符合等效限的要 求,，表明該方法具有良好的正確度。
使用配備八池四溫區(qū)控溫附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定酶催化活性濃度,，在人員和試劑等因素穩(wěn)定的前提 下,，能夠滿足科研和常規(guī)測(cè)量工作的要求。與傳統(tǒng)的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)配置的水控溫/半導(dǎo)體控溫附件相比,，Cary 3500 UV-Vis 八池四溫區(qū)控溫附件在酶催化反應(yīng)測(cè)試領(lǐng)域中具有以下明 顯優(yōu)勢(shì)：
1) 溫度是酶催化反應(yīng)過(guò)程的重要影響因素,。IFCC 參考方法要求將 實(shí)驗(yàn)溫度控制為 37 ± 0.1 °C，如果溫度控制失敗會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 錯(cuò)誤及昂貴樣品的浪費(fèi),。傳統(tǒng)多池控溫附件很難將所有池位的溫 度差控制在 ± 0.1 °C,，所以經(jīng)常當(dāng)作單池使用或者挑出溫差小的 部分池位（2 至 3 個(gè)）使用，操作繁瑣,，實(shí)驗(yàn)效率低,。Cary 3500 UV-Vis 的八池四溫區(qū)控溫附件，每?jī)蓚€(gè)池位由一組控溫模塊獨(dú) 立控制,，相當(dāng)于同步運(yùn)行四臺(tái)單獨(dú)的控溫設(shè)備,。通過(guò)軟件參數(shù)設(shè) 置，可將每個(gè)池位溫度控制在 IFCC 要求的 37 ± 0.1 °C 區(qū)間內(nèi),， 同步完成四個(gè)樣品的測(cè)試,，對(duì)于酶參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行國(guó)際比對(duì)工作 的高通量樣品測(cè)試需求具有重要的意義 2) 傳統(tǒng)的控溫附件采用水浴循環(huán)的方式控溫，噪聲大且溫度升 降的緩沖時(shí)間較長(zhǎng),，每次實(shí)驗(yàn)前需要留出一定的時(shí)間 (> 30 min) 等待溫度平衡,。Cary 3500 UV-Vis 采用空冷控溫，升溫速度快,， 5–10 min 即可實(shí)現(xiàn)溫度平衡,。且無(wú)需水浴，避免了實(shí)驗(yàn)室噪聲以 及水浴長(zhǎng)菌的困擾,，用戶體驗(yàn)度更佳 3) 與此同時(shí),，Cary 3500 UV-Vis 采用氙燈光源，光源壽命為 20000 小時(shí)以上,，控溫模塊采用全新的一體式設(shè)計(jì),，無(wú)任何移動(dòng) 部件。因此儀器無(wú)需任何維護(hù),，用戶維護(hù)成本低
參考文獻(xiàn) 1. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Scientific Division, Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE). IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 °C: Part 4. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alanine Aminotransferase