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使用LC-MS/MS 對全血中的THC 和代謝物進行高效定量分析
閱讀：908 發(fā)布時間：2021-1-13摘要：復(fù)雜生物樣品的高效提取、凈化和分析對法醫(yī)學(xué)實驗室極為有益,。磷脂 (PPL) 已被確定為在全血中四氫da麻酚 (THC) 及其代謝物的 LC-MS/MS 分析中引起基質(zhì)效應(yīng)的主要來源,。本應(yīng)用簡報介紹了全血中的 ?9 -THC (THC) 及其主要代謝物 11-羥基-?9 - THC (THC-OH) 和 11-nor-9-羧基-?9 -THC (THC-COOH) 的提取和 LC-MS/MS 分析。樣品前處理中采用孔內(nèi)蛋白質(zhì)沉淀法 (PPT) 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 直通 1 mL 過濾柱去除 PPL,。Captiva EMR-Lipid 能夠得到更潔凈的洗脫液,，去除全血基質(zhì)中 97% 以上不需要的 PPL，且目標(biāo)分析物的回收率高于 92%,。對 1 ng/mL THC,、THC-OH 和 THC-COOH 的分析得到了理想的峰形，并獲得了良好的信噪比 (S/N),。在 0.5 至 100 ng/mL 范圍內(nèi)獲得的響應(yīng)呈線性,，R2 高于 0.99。獲得的定量限在 1.0 ng/g 以下,，RSD 小于 11.5%,。在三天的實驗過程中，得到的結(jié)果一致,。
前言：在法醫(yī)學(xué)實驗室中,，LC-MS/MS 分析之前高效的樣品前處理是一個重要考慮因素,。樣品前處理可用于減少系統(tǒng)污染并改善數(shù)據(jù)完整性,、方法選擇性、分析靈敏度和可靠性,。全血中存在的兩種主要干擾物為是蛋白質(zhì)和磷脂 (PPL)。PPL 已被確定為 LC-MS/MS 生物分析中引起基質(zhì)效應(yīng)的主要來源,，因為在電噴霧電離 (ESI) 期間所形成的液滴表面上會發(fā)生競爭電離1 ,。常用的法醫(yī)學(xué)樣品前處理技術(shù)包括蛋白質(zhì)沉淀 (PPT)、固相萃取 (SPE),、液液萃取 (LLE) 和介質(zhì)液液萃取 (SLE)。每種技術(shù)在速度,、成本和生成數(shù)據(jù)的質(zhì)量方面各有優(yōu)劣。例如,，PPT、 LLE 和 SLE 無法去除 PPL,，而 SPE 執(zhí)行起來更耗時且更復(fù)雜2 ,。然而，在這些技術(shù)中,，PPT 得到了廣泛的認可,。PPT 以規(guī)定的比例向生物樣品中加入有機沉淀溶劑（如乙腈 (ACN) 或甲醇 (MeOH)），可輕松高效地除去蛋白質(zhì),。隨著蛋白質(zhì)的變性,，它們形成的沉淀可通過過濾或離心得以去除。但 PPT 無法去除 PPL,，因為 PPL 能夠溶于有機沉淀溶劑中,。大麻物質(zhì)類是支持案件調(diào)查的法醫(yī)學(xué)實驗室中常見的目標(biāo)分析物之一?？焖?、準(zhǔn)確地確認并定量生物樣品中的 ?9 -THC (THC) 及其主要代謝物 11-羥基-?9 -THC (THC-OH) 和 11-nor9-?9 -羧基-THC (THC-COOH) 至關(guān)重要。然而,，THC 及其代謝物在樣品前處理過程中容易發(fā)生非特異性結(jié)合,。迫切需要一種全血樣品前處理方法，在減少樣品前處理步驟（包括離線 PPT,、離心,、轉(zhuǎn)移和稀釋）的同時實現(xiàn)簡化的孔內(nèi) PPT 和 PPL 去除。本應(yīng)用簡報介紹了一種借助 Agilent Captiva EMR-Lipid 1 mL 過濾柱去除干擾物質(zhì)（特別是 PPL）的方法,，該方法采用簡單的直通形式,，不會引起分析物損失。所得的提取物更潔凈,，減少了潛在的離子抑制以及色譜柱和質(zhì)譜儀污染,。
依次使用孔內(nèi) PPT 和 Captiva EMR-Lipid 過濾柱去除 PPL,，對全血中的 THC、THC-OH 和 THC-COOH 進行提取,。隨后使用 Agilent 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進行定量分析,。對 PPL 去除率進行了評估。還測定了 THC 及其代謝物的日間（3 日）準(zhǔn)確度,、精密度和回收率,。有關(guān)血漿樣品的分析，請參見安捷倫應(yīng)用簡報使用 Captiva EMR-Lipid 和 LC-MS/MS 對人血漿中的 THC 和代謝物進行高效定量分析3 ,。
實驗部分：試劑與化學(xué)品 ?9 -THC,、11-羥基-?9 -THC、11-nor-9-?9 -羧基-THC,、?9 - THC-d3,、11-羥基-?9 -THC-d3 和 11-nor-9-羧基-?9 -THC-d9 購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA),。LC-MS/MS 級甲酸銨同樣購自 Sigma-Aldrich,。所有溶劑均為液相色譜級或更高級別，均購自 Burdick and Jackson (Muskegon, MI, USA),。溶液在甲醇中配制濃度為 10 µg/mL 的 THC 及其代謝物 THC-OH 和 THC-COOH 的混標(biāo)工作溶液,。將氘代 THC-d3、THC-OH-d3 和 THC-COOH-d9 混合到工作溶液中,，濃度為 10 µg/mL（溶于甲醇中）,，并用作內(nèi)標(biāo) (IS),。校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)量控制樣品在預(yù)加標(biāo)質(zhì)量控制 (QC) 樣品中加入適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行配制七份,。QC 樣品為低濃度 QC (LQC),、中等濃度 QC (MQC) 和高濃度 QC (HQC)，分別對應(yīng)于全血中 1,、10,、 50 ng/mL 的濃度。在每種濃度的 QC 樣品中,，添加濃度為 50 ng/mL 的氘代混標(biāo)溶液 (IS),。在經(jīng)過 Captiva EMR-Lipid 凈化的空白基質(zhì)中，用 THC 及其代謝物的工作溶液后加標(biāo)，其加標(biāo)濃度分別對應(yīng)于全血中 1,、 10,、50 ng/mL 的濃度。另外,，還加入一份 5 µL 的 1.0 µg/mL IS 溶液,。基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制得,。對經(jīng)過 Captiva EMR-Lipid 凈化的空白基質(zhì)進行后加標(biāo),，加標(biāo)濃度對應(yīng)于提取物中 0.5、1,、5,、10、50,、100 ng/mL 的濃度,。在每種濃度的校準(zhǔn)標(biāo)樣中加入 5 µL 1.0 µg/mL IS。
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結(jié)果與討論：去除不需要的脂質(zhì)基體 EMR-Lipid 方法簡便,，通用于極性,、中等極性和非極性的目標(biāo)物分析，可消除基質(zhì)效應(yīng)并改善分析物回收率,。EMR-Lipid 利用*的吸附劑化學(xué)作用,，用水活化 EMR-Lipid 吸附劑后，能通過體積排阻和疏水性相互作用選擇性捕集脂類（圖 2）,。脂類上的無支鏈烴鏈進入吸附劑中,，而體積較大的分析物并不進入其中。然后,，進入吸附劑中的脂鏈通過疏水相互作用被捕集,。PPL 是細胞膜的主要成分，大量存在于全血中,。PPL 是由磷酸酯和膽堿單元組成的親水性頭部基團以及由長鏈烷基組成的疏水性尾部構(gòu)成,。