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PerkinElmer QSight 測定牛奶中多種抗生素藥物殘留量
閱讀：818 發(fā)布時(shí)間：2020-12-23簡介：抗生素曾被廣泛用于獸藥生產(chǎn)中，用于預(yù)防和治 療 疾 病 及 促 生 長 劑等,?？股氐臑E用終導(dǎo)致牛奶、肉類等動物源性食品中抗生素殘留量嚴(yán)重超標(biāo),，對人們健康帶來風(fēng)險(xiǎn),?？股氐臍埩魰?dǎo)致毒副反應(yīng)，例如過敏反應(yīng),、皮疹和惡心,。另外，長期攝入抗生素殘留的食品,，會導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌的傳播,。因此，世界各國都實(shí)施了動物抗生素使用法規(guī),。例如,，歐盟和加拿大制定了食品中藥物高殘留量（MRL），美國將其稱為耐受水平,。法規(guī)規(guī)定牛奶中抗生素殘留種類包括磺胺類,、β內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類,、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素,。本文中牛奶里各類抗生素的*如表 1 所示。
本文建立了牛奶中抗生素多殘留的LC/MS/MS測定方法,?？股胤N類包括環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星,、氧氟沙星,、青霉素 G、氯唑西林,、替米考星,、泰樂菌素、紅霉素,、磺胺二甲嘧啶,、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶,、四環(huán)素和金霉素,。以及兩種同位素內(nèi)標(biāo)為環(huán)丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3。采用改良的 QuEChERS 方法對牛奶中抗生素進(jìn)行提取,。本方法具有良好的線性,，高靈敏度、回收率穩(wěn)定,、重現(xiàn)性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn),，滿足世界各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)規(guī)定的牛奶中抗生素類殘留*的要求。
實(shí)驗(yàn)方法：儀器設(shè)備 Perkinelmer Altus ™ UPLC® 液 相 系 統(tǒng)， 含 Altus A-30 溶 劑 管 理 模 塊,、 樣 品 管 理 器 和 柱 溫 箱,。 質(zhì) 譜 儀： Perkinelmer QSight ™ 210 三重四極桿質(zhì)譜儀。Simplicity 3Q ™軟件平臺控制所有儀器,、采集和處理數(shù)據(jù)。方法參數(shù)液相色譜方法以及質(zhì)譜離子源參數(shù)見表 2,。溶劑,、標(biāo)準(zhǔn)物及樣品前處理所用的溶劑、試劑和稀釋液純度均為 LC/MS 級,?？股貥?biāo)準(zhǔn)物購自 Sigma-Aldrich® 公司，并于 4℃冰箱中保存,。除了 β- 內(nèi)酰胺類使用水作為溶劑外,，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β- 內(nèi)酰胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液需保存于塑料瓶中,，其余抗生素類標(biāo)準(zhǔn)溶液可保存在塑料或玻璃瓶中,。
從 C18 凈化劑購于 Supelco 公司。所有母液和工作標(biāo)準(zhǔn)溶液均冷藏保存,，并使用 2mL 的棕色進(jìn)樣小瓶,，以防止化合物降解。同位素內(nèi)標(biāo)的使用：環(huán)丙沙星-d8用于氟喹諾酮,，磺胺類和四環(huán)素類,，氟尼辛-d3用于大環(huán)內(nèi)酯和β-內(nèi)酰胺類。
采用當(dāng)?shù)厥袌鲑彽糜袡C(jī)牛奶作為空白樣品,，并對不同脂肪含量的 5 種牛奶樣品進(jìn)行抗生素殘留檢測,。采用簡單改良過 QuEChERS 前處理方法 2,3。具體步驟如下：（1）往 5mL 空白有機(jī)牛奶（已添加標(biāo)準(zhǔn),，濃度為 15ng/mL）中加入 20mL 有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）,；（2）渦旋混勻 1min，置于 7800rpm 下離心 10min,；（3）移取上清液,，加入 1.2mg 的 C18 凈化劑 ，用于除去脂肪,；（4）渦旋 5min,，7800rpm 下離心 5 分鐘；（5）提取 12.5mL 上清液,，于 40℃用氮?dú)獯抵?1.5- 2mL,；（6）用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL，渦旋混勻；（7）過 0.22µm PVDF 微孔濾膜,。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析,，待上述步驟 7 完成后在進(jìn)行基質(zhì)配標(biāo)及添加內(nèi)標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在 0.1ng/ mL-1000ng/mL,，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣 5 次,，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。
質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)化合物均采用正離子模式的電噴霧模式檢測,。采用蠕動泵和液相色譜儀相結(jié)合,，以三通連接的方式來優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：如氣體流量、離子源溫度以及離子源的位置,。蠕動泵以10µL/min的流速將0.5μg/mL磺胺甲嘧啶注入質(zhì)譜,，液相色譜儀以 0.5mL/min 的流速，溶液為乙腈水溶液（V/V,， 10/90,，含 0.1% 甲酸，5mM 甲酸銨）注入質(zhì)譜中,。每個(gè)化合物均采用濃度為 0.5μg/mL 來優(yōu)化碰撞能量,。Q1 和 Q3 的分辨率為 0.7amu。各個(gè)化合的質(zhì)譜參數(shù)詳見表 3,，每個(gè)化合物均采集 3 對 MRM 離子對,，以降低假陽性或假陰性結(jié)果。
結(jié)果與討論：按照上述確定的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測試,，各各個(gè)抗生素的校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)及 LOQ 見表 4,。各個(gè)抗生素的 LOQ 比法規(guī)中耐受水平還要低至 5-100 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，本方法*牛奶中抗生素的檢測要求,。圖 1 為牛奶基質(zhì)加標(biāo)樣品（濃度為 5ng/mL）中磺胺甲嘧啶的提取離子色譜圖，從圖1可以看出,，具有較高的信噪比,。采用空白牛奶基質(zhì)作為稀釋液，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（9 個(gè)濃度點(diǎn)）,，基質(zhì)配標(biāo)曲線范圍為 0.1-1000ng/mL,。圖 2 為磺胺二甲嘧啶校準(zhǔn)曲線示例，線性范圍大于 4 個(gè)數(shù)量級,。所有抗生素化合物的校準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù) R2 均大于 0.9958,，具有良好的線性關(guān)系。表 5 為目標(biāo)化合物在不同濃度下連續(xù)進(jìn)樣的重現(xiàn)性數(shù)據(jù),。