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如何采用Ostro 96孔樣品制備板提高DBS萃取物的潔凈程度
閱讀：600 發(fā)布時(shí)間：2020-12-22引言：干血斑分析法（DBS）在醫(yī)藥行業(yè)正變得愈發(fā)重要,。動物實(shí)驗(yàn)所帶來的經(jīng)濟(jì)及倫理道德方面的問題,，以及在運(yùn)輸以及儲存生物樣品時(shí)所產(chǎn)生的高額費(fèi)用問題，都使得DBS分析法成為一種頗具吸引力的選擇,。DBS 分析法可取得較高的分析物回收率,。然而，該技術(shù)在去除內(nèi)源性干擾方面收效甚微,。以殘余磷脂（PLs）為主的干擾物是生物分析中遇到的主要問題,。而LC/MS/MS系統(tǒng)中PLs的蓄積，則是引發(fā)基質(zhì)效應(yīng)的主要原因,。在所有其他問題之中,，基質(zhì)效應(yīng)會以無可預(yù)測的方式影響質(zhì)譜響應(yīng)值，降低分析方法穩(wěn)定性并增加其可變性,。Ostro 96孔樣品制備板則可消除99%以上的PLs殘留,。Ostro 96孔板可通過使用96孔制備板的形式進(jìn)一步簡化DBS萃取流程，同時(shí)提取分析物,、去除磷脂,、過濾干血斑紙片。DBS樣品可在孔內(nèi)萃取并稀釋直接進(jìn)樣到LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中,。該創(chuàng)新方法能夠顯著降低樣品制備時(shí)間,，并在萃取轉(zhuǎn)化、干燥,、復(fù)溶過程中避免潛在的分析物流失,。在本應(yīng)用紀(jì)要中,，我們同時(shí)應(yīng)用了傳統(tǒng)方法和Ostro 96孔樣品制備板方法，對含有利培酮,、利培酮羥基化代謝物,、 9-OH利培酮及其內(nèi)標(biāo)氯氮平（圖1）的全血樣品進(jìn)行了萃取。
實(shí)驗(yàn)部分： ACQUITY UPLC條件色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18,， 2.1×50 mm,，1.7 μm 流動相A： 0.1% NH4OH 水溶液流動相B： 50/50 ACN/MeOH 流速： 0.6 mL/min 梯度： 時(shí)間 梯度模式 梯度線型 (min) %A %B 0.0 75 25 6 2.0 0.5 99.5 6 3.0 0.5 99.5 6 3.1 75 25 6 3.5 75 25 6 進(jìn)樣量： 40 μL 進(jìn)樣模式： 部分環(huán)進(jìn)樣柱溫： 35 ℃ 樣品溫度： 15 ℃ 強(qiáng)洗針液： 60:40 ACN:IPA＋2% HCOOH 弱洗針液： 95/5 H2O/MeOH 沃特世Xevo TQ-S MS運(yùn)行條件，ESI + 毛細(xì)管電壓： 3.0 V 脫溶劑溫度： 550 ℃ 錐孔氣流速： 150 L/Hr 脫溶劑氣流速： 1000 L/Hr 碰撞池壓力： 2.6×10(-3) mbar MRM通道監(jiān)測,，ESI+參見表1
樣品制備條件將20 μL的全血樣品滴在未經(jīng)處理的Whatman DMPK-C血卡上,。樣品隨后在室溫下干燥2小時(shí)。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm 血斑,，分別放置進(jìn)傳統(tǒng)型DBS 萃取法所需的1.5 mL離心管和 Ostro 96孔板孔中,。傳統(tǒng)萃取方法在1.5 mL離心管中進(jìn)行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液,，隨后樣品進(jìn)行1分鐘渦旋,、1分鐘3000 g離心，并終將萃取物轉(zhuǎn)移至96孔板上,。使用Ostro 96孔板的萃取則采用單步孔內(nèi)萃取法,。在Ostro 96孔板中添加 3 mm干血斑（圖2）。以250 μL 含5%水的甲醇溶液作為萃取溶液,，渦旋操作1分鐘,、真空操作5分鐘。兩種方法產(chǎn)生的洗脫液都用 250 μL 的水進(jìn)行稀釋,，然后進(jìn)樣到LC/MS/MS系統(tǒng)中,。
結(jié)果與討論：在正離子模式下進(jìn)行MS分析。鑒于DBS萃取物的直接進(jìn)樣通常會導(dǎo)*稀釋的樣品,，我們采用 Xevo TQ-S以顯著提升系統(tǒng)的靈敏度,。這同時(shí)也有助于直接進(jìn)樣，并避免了吹干,、復(fù)溶過程中可能存在的問題,。針對每一種樣品制備方法，我們都比較了磷脂殘留量,。為了達(dá)成這一目的,，我們對單個(gè)試管萃取和使用Ostro PLR板孔內(nèi)萃取的DBS進(jìn)行了比對，對五種磷脂進(jìn)行了量化,。與傳統(tǒng)型DBS分析法相比,，Ostro板去除磷脂比例高達(dá)99.9%（圖3）。為能直觀展示殘余磷脂，傳統(tǒng)型DBS萃取法和使用 Ostro的孔內(nèi)DBS萃取法所產(chǎn)生的五種不同磷脂的總離子流（TIC）如圖所示（圖4）,。當(dāng)使用Ostro板時(shí),，磷脂殘留量幾乎可忽略不計(jì)，且無蓄積情況,。而當(dāng)使用傳統(tǒng)型DBS法時(shí),，即便出于預(yù)防磷脂蓄積的目的，采用高比例有機(jī)溶劑進(jìn)行了1分鐘的清洗,，磷脂殘余量依舊顯著,，而且在整個(gè)過程中都有蓄積。我們進(jìn)行了半驗(yàn)證,，計(jì)算QC樣品濃度不足預(yù)期值的15%,，滿足法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。9-OH利培酮（圖6）及其母化合物L(fēng)LOQ在全血中都達(dá)到 0.05 ng/mL,。標(biāo)準(zhǔn)曲線在3個(gè)以上數(shù)量級呈線性，全血中的線性范圍從0.05 ng/mL到50 ng/mL（圖7）,。
結(jié)論 ■ 簡便,、單步的DBS樣品制備方法 ■ 相較于傳統(tǒng)的DBS萃取技術(shù)，去除殘余磷脂含量高達(dá)99.9% ■ 采用Xevo TQ-S三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀,，獲得高靈敏度 ■ 去除LC色譜柱中PLs的蓄積