化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
中藥中齊墩果酸和熊果酸的準確定量分析-高分辨率采樣二維液相色譜
閱讀：1679 發(fā)布時間：2020-12-10摘要： 質(zhì)量控制是中藥 (TCM) 行業(yè)中重要的任務(wù)之一。在質(zhì)量控制中,，要求用 HPLC 方 法測定 TCM 中主要化合物的含量,。鑒于 TCM 樣品的復(fù)雜性，目標化合物有可能與 其他微量化合物在 HPLC 分離中發(fā)生共洗脫。二維液相色譜是一個采用正交色譜柱 化學鍵合相和流動相的強大方法,，該方法可分離復(fù)雜樣品,。本應(yīng)用簡報詳述了如何 開發(fā)用于翼首草 (Pterocephali Herbra) 中齊墩果酸和熊果酸定量分析的高分辨率采樣 二維液相色譜方法。
前言 中藥 (TCM) 分析是一項挑戰(zhàn)的任 務(wù),，因為無論是一種草藥還是復(fù)方制劑,， 含有的成分都非常復(fù)雜。為控制 TCM 的 質(zhì)量,，需要使用《中國藥典》(CHP) 中規(guī) 定的 HPLC二維液相色譜 方法測定其中主要化合物的含 量,。通常來說，其他化合物將與目標化合 物發(fā)生共洗脫,，從而影響定量準確度,。 在《中國藥典》中，翼首草是一個需要 用 HPLC 方法測定齊墩果酸和熊果酸（圖 1）兩種目標化合物含量的示例,。本研究 發(fā)現(xiàn),，其他幾種化合物會與齊墩果酸和熊 果酸發(fā)生共洗脫，使現(xiàn)有方法不足以對這 些化合物進行定量分析,。
為實現(xiàn)正交分離,，本應(yīng)用簡報使用兩根選 擇性不同的 Agilent InfinityLab Poroshell 120 色譜柱（EC-C18 和 Phenyl-Hexyl）， 并在高分辨率采樣二維液相色譜中采用了 不同的流動相條件,。在選定時間范圍內(nèi)收 集幾個涵蓋一維色譜圖中整個峰面積范圍 的小體積餾分,，以此測定兩個目標化合 物。每次切割都駐留在采樣環(huán)中,，并在第 二維中對所有切割進行連續(xù)分析,。這一模 式可確保所有選定化合物均轉(zhuǎn)移至第二 維，并在其中得到分析,。因此,，選定的共 洗脫化合物都接受了高分辨率采樣處理， 以在第二維中得到分析,。如之前出版的技 術(shù)概述1 所示,，這一操作可實現(xiàn)可靠的定 量分析。
實驗部分 化學品和樣品 所有試劑和溶劑均為 HPLC 級,。乙腈和 甲醇購自 JT Baker, USA,。乙酸銨購自 北京百靈威科技有限公司。新制超純 水產(chǎn)自 ELGA 水純化系統(tǒng),，Lane End, UK。翼首草提取物以及齊墩果酸和熊 果酸對照品由中國當?shù)匾患抑扑幑咎?供,。將齊墩果酸和熊果酸同時溶于甲醇 中配制儲備標準溶液,，二者濃度分別為 2.3 mg/mL 和 2.0 mg/mL。 儀器 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜包括 以下模塊： • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備樣品冷卻裝置（選 件 #100） • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II MCT (G7116B) • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II DAD (G7117B),，配備 10 mm 大光強 卡套式流通池 (G4212-60008) 和 60 mm 大光強卡套式流通池 (G4212- 60007) • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動 (G1170A) 和 2 位/4 通雙向閥（二維 液相色譜閥頭,，G4236A） • 兩個 Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動 (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環(huán)的 多中心切割閥 (G4242-64000)
高分辨率采樣方法設(shè)置 高分辨率采樣方法設(shè)置參考了之前發(fā)布 的技術(shù)概述1 ,。圖 3 顯示 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜的高分辨率采樣配 置,，包括 2 位/4 通雙向閥，與帶有 12 個 定量環(huán)的多中心切割閥相連,。采用這一設(shè) 置后,，多可對 10 次連續(xù)切割進行采樣 與儲存以待分析。對于高分辨率采樣,，為 避免發(fā)生任何樣品損失,，建議定量環(huán)充填 量大為 80%。圖 4 顯示了二維泵的使 用方法設(shè)置,。首先,，運行一維液相色譜分 離樣品，并將色譜圖加載為參比信號預(yù)覽 窗口,?；跁r間高分辨率采樣以目標峰為 依據(jù)，8 次切割涵蓋了整個峰寬,。在給定 一維條件下,，采樣時間為 8.63 秒，相當 于 72% 的定量環(huán)填充,。
結(jié)果與討論 分離 圖 5 顯示采用根據(jù) CHP 方法的優(yōu)化方 法,，對翼首草中的齊墩果酸和熊果酸進行 分析得到的典型色譜圖。在這一方法中,， 采用 InfinityLab Poroshell 120 4 µm 為對 照品提供了良好的分離度,，而樣品極其復(fù) 雜，因此目標分析物未能與其他干擾化合 物實現(xiàn)充分分離,。因此,，使用傳統(tǒng)一維液 相色譜分離無法對目標分析物進行定量 分析。 使用高分辨率采樣二維液相色譜可將這兩 種目標化合物從干擾化合物中分離,，實現(xiàn) 正確的定量分析,。利用不同選擇性的色 譜柱化學鍵合相可達到這一目的。在 2.7 和 1.9 µm 表面多孔顆粒填料上引入多 種化學鍵合相,，使 InfinityLab Poroshell 120 色譜柱成為實現(xiàn)二維 HPLC 分離所 需正交分離的選擇,。該方法使用 Phenyl-Hexyl 色譜柱作為。齊墩 果酸和熊果酸兩種目標化合物在 Agilent InfinityLab Poroshell 120 Phenyl-Hexyl, 2.1 × 100 mm, 1.9 µm 色譜柱上實現(xiàn)了 基線分離,，如圖 6A 所示,。亞 2 µm 表面 多孔顆粒填料 Poroshell 色譜柱對兩個窄 峰寬化合物表現(xiàn)出高柱效和良好的分離 度,，使二維分離采樣更輕松。第二維分 離使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 3.0 × 50 mm, 2.7 µm 色譜柱,。這 款色譜柱反壓低,，可采用高流速使目標化 合物與共洗脫化合物實現(xiàn)快速分離。使 用高分辨率采樣,，對包含齊墩果酸和熊 果酸色譜峰的時間范圍進行 8 次切割采 樣（圖 6A）,，并進樣至第二維進行分析 （圖 6D）。