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SCIEX 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定果糖,、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的應(yīng)用
閱讀：3649 發(fā)布時(shí)間：2020-12-9引言：傳統(tǒng)檢測(cè)單糖,、雙糖的分析方法有化學(xué)法、光譜法,、GCMS,、HPLC等方法。其中化學(xué)法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定單種糖的含量,；光譜法的工作繁瑣,、誤差比較大；GC-MS方法需要進(jìn)行衍生化反應(yīng),，前處理復(fù)雜,，不利于快速分析；HPLC法雖然相比其他方法靈敏度好,、檢測(cè)速度快,、適用范圍廣，但也存在檢出限較低,、抗干擾能力差,，尤其對(duì)于食品中低濃度的單糖、雙糖很難進(jìn)行測(cè)定,，無(wú)法滿足現(xiàn)階段對(duì)食品檢測(cè)快速,、靈敏、準(zhǔn)確的要求,。LCMS/MS技術(shù)通過(guò)質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏度能夠降低目標(biāo)物的檢出限,、提高檢測(cè)的重現(xiàn)性。由于糖類為水溶性化合物,，在常規(guī)的C18色譜柱上沒(méi)有保留,，而采用其他填料的親水色譜柱也很難得到太好的峰形或分離度。因此,，選取一款合適的分析糖的色譜柱是液質(zhì)分析糖的實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn),。目前專門測(cè)試糖的糖柱通常為液相柱，需要用到100%純水相來(lái)作為流動(dòng)相,，并且流速通常高于1 mL/min,，這樣的色譜條件對(duì)于大多數(shù)的質(zhì)譜離子源來(lái)說(shuō)都無(wú)法實(shí)現(xiàn)化合物的有效離子化,，或者只有通過(guò)分流才能實(shí)現(xiàn)，但是分流后將損失儀器的檢測(cè)靈敏度,，失去了使用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)試糖的提高靈敏度的目的,。 SCIEX 的LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的一大特點(diǎn)就是強(qiáng)大的 TurboV™離子源技術(shù)，離子源的加熱能夠達(dá)到750℃,，ESI源耐受流速范圍 5 µL/min～3.0 mL/min，APCI源耐受流速范圍50 µL/ min～3.0 mL/ min,，因此可以直接使用HPLC糖柱在SCIEX液質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行測(cè)試,，即實(shí)現(xiàn)了好的分離效果，又提高了檢測(cè)靈敏度,。本實(shí)驗(yàn)使用SCIEX Triple Quad™ 4500 質(zhì)譜系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定梨中的葡萄糖,、果糖、蔗糖和山梨醇四種糖, 實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單,、靈敏度高,、選擇性好。
實(shí)驗(yàn)思路 1. 配制果糖,、葡萄糖,、蔗糖和山梨醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)試四種水溶性糖的低檢出限,； 2. 測(cè)試碭山酥梨果實(shí)中四種水溶性糖的含量,，了解梨中四種糖的比例關(guān)系。
樣品處理 1．移取果糖,、葡萄糖,、蔗糖和山梨醇標(biāo)準(zhǔn)品，用純水稀釋,，配制成 50 ng/mL,、100 ng/mL、500 ng/mL,、1 µg/mL,、5 µg/mL 和 10 µg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2．梨果實(shí)中可溶性糖的提取,。
梨果實(shí)中糖的提取材料：碭山酥梨（采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦園藝實(shí)驗(yàn)站）將樣品去皮削成小塊,，液氮速凍后儲(chǔ)存于-80冰箱。稱取2g樣品,，加液氮研磨后,，加入80%乙醇7 mL混勻。在37℃水浴中恒溫 30 min,，超聲提取15 min,，10000 r/min離心15 min,。將上清液移入25 mL容量瓶。重復(fù)提取3次,，后加入80%乙醇定容至25 mL,。取2 mL溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用1 mL水溶解蒸干后的固體,，溶解時(shí)用超聲波處理,，盡量溶解*。溶液離心后,，用0.22 µm水系濾膜處理,，即可用于測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)此前處理過(guò)程提取出的糖樣品在液質(zhì)儀器上的響應(yīng)信號(hào)過(guò)高,，終樣品又用純水稀釋10倍和1000倍分別上機(jī)測(cè)試,。
色譜方法色譜柱：Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm；流動(dòng)相：100%純水洗脫流速：1 mL/min,； 柱溫：85℃,；進(jìn)樣量：10 µL
質(zhì)譜方法 SCIEX Triple Quad™ 4500 質(zhì)譜系統(tǒng) 掃描方式：MRM采集方式離子源：APCI Negative 離子源參數(shù) CUR：氣簾氣 25.00 psi NC：離子化電流 -2.00 uA TEM：加熱溫度 400.00 ℃ GS1：噴霧氣 75psi CAD：碰撞氣 Medium
掃描方式：MRM采集方式離子源：APCI Negative 離子源參數(shù) CUR：氣簾氣 25.00 psi NC：離子化電流 -2.00 uA TEM：加熱溫度 400.00 ℃ GS1：噴霧氣 75psi CAD：碰撞氣 Medium
結(jié)果與討論 ：1、色譜條件的選擇本實(shí)驗(yàn)選擇使用液相糖分析柱Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm,， 1 mL/min 純水流動(dòng)相,，對(duì)果糖、葡萄糖,、蔗糖和山梨醇四種糖進(jìn)行分離,，其中果糖和葡萄糖為同分異構(gòu)體，用該色譜柱可以得到很好的分離,，每種化合物的峰形都很對(duì)稱,，峰形較
3、樣品提取條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)中樣品提取過(guò)程基于以前使用液相檢測(cè)時(shí)的靈敏度而開(kāi)發(fā),，因此在用80%乙醇水對(duì)樣品提取之后,，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)再用純水復(fù)溶的過(guò)程將80%乙醇水溶劑替換成純水。而采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)方法檢測(cè)靈敏度比液相提高1000倍以上,，樣品濃度無(wú)需過(guò)高,，因此在原有的提取步驟之后，只需用純水將樣品稀釋10倍以上,，過(guò)濾膜即可上機(jī)測(cè)試,。既可以降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)，又大大縮短了樣品前處理所需時(shí)間,。
……
總結(jié)：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SCIEX LC-MS/MS技術(shù)同時(shí)檢測(cè)了果糖,、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四種可溶性糖，實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了不同的色譜柱對(duì)靈敏度的影響,，終選擇了HPLC糖柱來(lái)分析,。利用了SCIEX Turbo V™ 離子源強(qiáng)大的耐高流速的特點(diǎn)，在SCIEX Triple Quad™ 4500系統(tǒng)上直接使用了HPLC色譜條件,，100%純水1mL/min流速下做液質(zhì)分析,，依然得到了良好的檢測(cè)靈敏度。方法的定量限≤50ng/mL,。以碭山酥梨為樣品進(jìn)行了可溶性糖的提取前處理,，用該液質(zhì)方法進(jìn)行糖含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的栽培處理梨中糖分含量差異很大,，以含糖量高時(shí)的梨樣品為例,，推算出此時(shí)1個(gè)梨果實(shí)中約含果糖12g、葡萄糖7g,、蔗糖7g、山梨醇32g,。 SCIEX LC-MS/MS系統(tǒng)具有穩(wěn)定耐用易維護(hù),，靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，Turbo V™離子源技術(shù)使質(zhì)譜檢測(cè)耐受不同的液相流速,，方法建立和開(kāi)發(fā)更加簡(jiǎn)便,，即使是HPLC的高流速純水方法依然能夠得到很好的檢測(cè)效果。