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使用Agilent LC/MS/MS 分析雞蛋中的硝基咪唑
閱讀：887 發(fā)布時(shí)間：2020-8-25摘要：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)描述使用簡(jiǎn)單,、穩(wěn)定的通過式凈化和 安捷倫LC/MS/MS 分析測(cè)定雞蛋中的 4 種硝基咪唑（甲硝唑,、迪美唑、羅硝唑和異丙硝唑）及其羥基代謝物,。采用 QuEChERS 萃取和 Captiva EMR-Lipid 過濾柱凈化的樣品前處理步驟獲得了優(yōu)異的脂類和色素去除結(jié)果,。該方法在 3 個(gè) QC 濃度下均呈現(xiàn)出出色的準(zhǔn)確度 (85.6%–118.3%) 和精密度 (RSD < 6%)。
前言：硝基咪唑是用于家禽的一類活性抗生素,，也可用作食品動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)劑,。然而,，由于存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，許多國(guó)家/地區(qū)已禁止使用這類化合物1 ,。已有一些有關(guān)使用溶劑萃取2,3 和固相萃取 (SPE)4 來分析硝基咪唑的報(bào)道,。但是，溶劑萃取通常采用乙酸乙酯或二氯甲烷等強(qiáng)溶劑,，這些溶劑可萃取額外的基質(zhì),，從而在 LC/MS 分析期間造成干擾4 。SPE 方法包括乙腈萃取及隨后的陽離子交換固相萃取柱的凈化,，該方法可得到潔凈的洗脫液,，但在樣品前處理期間需要多個(gè)步驟和多次 pH 調(diào)節(jié),。 Captiva EMR-Lipid 是一款脂質(zhì)去除產(chǎn)品,，其將體積排阻與疏水相互作用兩種凈化機(jī)制相結(jié)合，能夠選擇性地捕獲脂類烴鏈,，同時(shí)不損失目標(biāo)分析物,。相比 SPE 的多步驟操作，EMR *的通過式功能可大大簡(jiǎn)化樣品前處理工作流程,。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)在分析雞蛋中的硝基咪唑及其羥基代謝物時(shí)使用 Captiva EMR-Lipid 進(jìn)行樣品凈化,，得到了優(yōu)異的回收率和精密度。圖 1 顯示了 4 種硝基咪唑及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu),。
實(shí)驗(yàn)部分：試劑與化學(xué)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或分析純級(jí),。乙腈 (ACN) 和甲醇 (MeOH) 購(gòu)自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。甲酸 (FA) 購(gòu)自百靈威科技有限公司（中國(guó)北京）,。硝基咪唑和內(nèi)標(biāo)購(gòu)自 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany),。溶液與標(biāo)準(zhǔn)品單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液由甲醇配制成 10 mg/mL，置于棕色容量瓶中并在 –20 °C 下儲(chǔ)存,?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)溶液 (1 mg/mL) 和內(nèi)標(biāo)混合物 (1 mg/mL) 在使用前由甲醇配制。
儀器與材料：采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜執(zhí)行分離操作,，該液相色譜與配備安捷倫噴射流電噴霧電離 (EI) 離子源的 Agilent 6495B 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)聯(lián)用,。Agilent 9000 氣相色譜系統(tǒng)聯(lián)用 Agilent 7000 GC/MS 三重四極桿系統(tǒng)，利用 GC/MS 全掃描評(píng)估基質(zhì)的去除情況,。采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析,。其他的樣品前處理所用的設(shè)備和材料包括： • SPEX 樣品前處理 2010 Geno/Grinder (Metuchen, NJ, USA) • Eppendorf 5810R 離心機(jī) (Hamburg, Germany) • Agilent Captiva EMR-Lipid 過濾柱， 3 mL,，300 mg（部件號(hào) 5190-1003） • Agilent Vac Elut 20 真空萃取裝置（部件號(hào) 12234101） • 用于獸藥的 Agilent QuEChERS 萃取試劑盒（部件號(hào) 5982-0032）
樣品前處理圖 3 展示了樣品前處理過程,。將雞蛋樣品混合均勻并準(zhǔn)確稱量 (5 g)。然后,，配制含 5% 甲酸的乙腈溶液用于提取,。實(shí)驗(yàn)表明,，高比例的甲酸可實(shí)現(xiàn)更好的蛋白沉淀效果，產(chǎn)生更多的沉淀,。選擇包含 4 g Na2SO4 和 1 g NaCl 的 QuEChERS 萃取包來凈化雞蛋樣品中的極性干擾物,。離心后，移取上層乙腈相 (2.4 mL) 至潔凈的試管中,，加入 0.6 mL 水進(jìn)行稀釋（水的體積百分比為 20%）并充分渦旋混合,。然后，將混合溶液轉(zhuǎn)移到 3 mL Captiva EMR-Lipid 凈化管中,，使其在重力作用下流過凈化管,。然后真空干燥過濾柱。后,，收集并渦旋洗脫液,，待進(jìn)樣。校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)量控制 (QC) 樣品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)標(biāo)樣溶劑的配制濃度為 0.1,、0.5,、1、5,、10,、50 和 100 ng/g。包含 DMZ-D3,、MNZ-D4 和 MNZOH-D2 的內(nèi)標(biāo)混合物的加標(biāo)濃度為 10 ng/g,。將適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入均質(zhì)化蛋樣品中，得到預(yù)加標(biāo)的 QC 樣品,，其中涵蓋低濃度 (1 ng/g),、中等濃度 (5 ng/g) 和高濃度 (10 ng/g)，各平行配制 6 份,。
結(jié)果與討論線性使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件處理數(shù)據(jù),。使用線性回歸擬合和 1/x 加權(quán)得到 7 種硝基咪唑和代謝物的校準(zhǔn)曲線，其 R2 值均在 0.993–0.995 之間,?；厥章屎途芏冉Y(jié)果表 1 顯示運(yùn)行 3 個(gè) QC 濃度的加標(biāo)樣品對(duì)先進(jìn)行 QuEChERS 萃取，然后進(jìn)行 Captiva EMR-Lipid 凈化的方法的驗(yàn)證結(jié)果,?；厥章蕿?86.5%–118.3%，RSD < 6%,。由于內(nèi)標(biāo)數(shù)量有限,，因此用 MNOH-D3 校準(zhǔn) MNZOH，用 MNZ-D4 校準(zhǔn) MNZ，用 DMZ-D3 校準(zhǔn) DMZ,、RNZ,、IPZ 和 IPZOH。由于 HMMNI 具有不同的化學(xué)特性,，因此未用任何內(nèi)標(biāo)對(duì)其進(jìn)行校準(zhǔn)