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賽默飛離子色譜法測定全血樣品中的膽堿
閱讀：1043 發(fā)布時(shí)間：2020-6-27引言：膽堿是一種水溶性B族維生素，在水溶液中以四價(jià)銨陽離子形式存在,，是 正常代謝*的物質(zhì),。準(zhǔn)確分析全血樣品中的膽堿，對于代謝等生物領(lǐng)域 具有很重要的作用,，是新型反應(yīng)急性冠脈綜合癥的指標(biāo),，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域意義重 大。同時(shí)膽堿（Choline）作為一種營養(yǎng)食品添加劑,，具有促進(jìn)大腦的發(fā)育,、改 善大腦的代謝、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞,、增強(qiáng)視力,、改善鈣的代謝等功能[1]。
國標(biāo)中檢測膽堿的方法有GB/T 5413.20-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測定》[2],，該方法采用酶水解,，分光光度法進(jìn)行測定，成本高效率低,。 近年來文獻(xiàn)報(bào)道食品中膽堿的測定方法為液相色譜法[3]和離子色譜法[4-6],，液相 色譜法一般采用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測，而此檢測器非常用檢測器,，該 方法不易推廣,。離子色譜電導(dǎo)檢測器檢測靈敏度高，選擇性好,，易推廣,，在 食品檢測方面應(yīng)用較多，但是應(yīng)用于全血樣品中膽堿的檢測鮮有報(bào)道,。血樣 不同于常規(guī)的食品樣品,，不易分散。實(shí)驗(yàn)室采用曲那通-X100對血樣進(jìn)行分散 處理后，采用鹽酸水解，離子色譜進(jìn)行檢測。方法簡單易行,，準(zhǔn)確可靠,，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果滿足檢測的要求,。
測試條件：
儀器和試劑
賽默飛ICS-3000離子色譜系統(tǒng)（美國Dionex公司），電導(dǎo) 檢測器；自動進(jìn)樣器及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)處理工作 站；MiliQ-Element純水機(jī)（法國Millipore）,；KQ-500E型 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水 浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）,；0.22 µm尼龍濾膜,。 膽堿酒石酸氫鹽（純度98.0%，日本TCI試劑） ,； MiliQ-Element超純水,；鹽酸（優(yōu)級純，北京化工廠）,；曲 拉通X-100（化學(xué)純,，西隴化工股份有限公司）；甲烷磺 酸（色譜純,，sigma公司）,。文中所用血樣為雞血樣品。
色譜條件
色譜柱：IonPac CS12分析柱 （250 mm×4 mm）和 IonPac CG12保護(hù)柱（50 mm×4 mm）,； 淋洗液：甲烷磺酸（16 mmol/L）,； 抑制器：CSRS 300 4 mm ，外接水抑制模式,。 進(jìn)樣體積：100 µL。
樣品前處理方法：
準(zhǔn)確稱取約2 g全血樣品（真空采樣,，保存于4 ℃ 冰箱中可保持30天）于50 mL具塞玻璃錐形瓶中,，加入 27.5 mL 1.0%的曲拉通-X100溶液，超聲15 min,，再加 入1.5 mL鹽酸,，加蓋，混勻,。將錐形瓶放入70 ℃水浴 3小時(shí),，每小時(shí)搖一次。將水解產(chǎn)物冷卻至室溫,，用水 沖洗錐形瓶,，所得溶液過濾至容量瓶中，將濾液定容至 100 mL，此濾液可以在4 ℃下保存三天,。分析前用水繼續(xù) 稀釋此濾液10倍后,，過0.22 µm尼龍濾膜。同時(shí)準(zhǔn)備試劑 空白,。
結(jié)果和討論：
前處理?xiàng)l件的選擇
血樣不同于粉末的食品樣品,，凝固后很難在水溶液中 均勻分散，會大大的影響提取效率,。實(shí)驗(yàn)室采用了0.5 % 曲拉通X-100溶液（一種表面活性劑）對血樣進(jìn)行分散,， 并且采用超聲提取以提高提取率。實(shí)驗(yàn)室考察了超聲時(shí) 間（15 min,、30 min,、45 min、60 min）對提取效率的影 響,，從圖1可以明顯的看出,，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到15 min后， 提取率就沒有明顯的變化,，因此實(shí)驗(yàn)室選擇15 min作為超 聲時(shí)間,。
同時(shí)也考察了水解溶液中鹽酸的用量，選擇某血 樣,，研究采用不同的鹽酸溶液配是否會影響血樣的水解 效率,，不同的鹽酸配比條件采用實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行 檢測，所得結(jié)果見表1,。 方法1鹽酸用量越大,，所得濾液酸度較高，若直接 進(jìn)樣會使陽離子交換官能團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化,，色譜峰嚴(yán)重變 形,，因此必須再稀釋5倍后再進(jìn)樣。而采用方法2和方法 3進(jìn)行前處理,，所得濾液酸度就適合直接進(jìn)樣分析,，且已 經(jīng)滿足了水解的效果。方法3稀釋倍數(shù)增大一倍,，樣液 中膽堿的含量也能達(dá)到檢出限的要求,，且溶液更容易過 濾，可以進(jìn)一步提高工作效率,，所以實(shí)驗(yàn)室采用了方法3 的鹽酸用量進(jìn)行前處理,。
色譜柱的選擇
在常用的陽離子色譜柱中，IonPac CS17色譜柱同 樣可以分析血樣中的膽堿,，淋洗液濃度為6 mM的甲烷磺 酸,，對于IonPac CS17色譜柱分析奶粉中的膽堿色譜峰 對稱性更好,，所用淋洗液濃度低。但鈉離子,、銨離子和 鉀離子的分離度不好,，并且IonPac CS17更容易發(fā)生陽 離子交換官能團(tuán)的質(zhì)子化現(xiàn)象，與IonPac CS12A色譜柱 相比,，前處理后的溶液需要多稀釋5倍后進(jìn)樣,。可能會 影響含量較低的血樣的定量,。所以實(shí)驗(yàn)室采用了IonPac CS12A作為檢測用色譜柱,，等度淋洗。對于分離效果較 好的新的色譜柱來說,，淋洗液的濃度不超過20 mmol/L 均能滿足分離的要求,。由于血樣中成分較為復(fù)雜，鉀含 量較高,，如果淋洗液濃度太高,，鉀離子拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán) 重，所以終采用了16 mmol/L作為淋洗液條件
結(jié)論：
本方法采用鹽酸酸解,，使全血樣品中的膽堿釋放出 來,，前處理方法對膽堿提取效率高。處理后的樣品溶液 使用IonPac CS12A色譜柱分析,，抑制電導(dǎo)檢測,，膽堿色 譜峰型良好，檢測靈敏度高,，且可以同時(shí)測定其他5種常 見陽離子,。