化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
分析丙烯酰胺的實驗方法
閱讀：961 發(fā)布時間：2020-5-25化學(xué)試劑：丙烯酰胺Acrylamide,，C3H5NO,，CAS: 79-06-1 建議的內(nèi)標(biāo)：D3-丙烯酰胺
色譜流動相的制備：流動相A：在1 L HPLC級的水中，加入10 µL甲酸,。 流動相B：在1 L HPLC級的甲醇中,，加入10 µL甲酸。
樣品制備試劑 ：Carrez ReagentⅠ K4Fe(CN)6 • 3H2O,。 Carrez ReagentⅡ (七水合硫酸鋅) ZnSO4 • 7H2O,。
洗脫液的制備： Carrez 試劑Ⅰ：溶解37.5 g K4Fe(CN)6•3H2O于250 mL HPLC級的水中,。 Carrez 試劑Ⅱ：溶解 75 g ZnSO4 • 7H2O于250 mL HPLC級的水中。
樣品制備 ：基于Buhlert和Hartig等人提出的方法[1,，2]： 1. 稱量5 mL勻漿的樣品,； 2. 加入50 mL環(huán)己烷 / 丁基甲基醚 ( 95 / 5 ) 混合溶液進行脫脂； 3. 空氣干燥,； 4. 加入500 µL內(nèi)標(biāo)D3-丙稀酰胺溶液 ( 10 µg/mL, 溶解于 HPLC級的水中),，得到內(nèi)標(biāo)濃度約為10 ng/mL的溶液； 5. 加入95 mL HPLC級的水,，40 ℃超聲提取10 min (溶液中加入剪成碎片的過濾紙),； 6. 加入2.5 mL Carrez 試劑Ⅰ和2.5 mL Carrez 試劑Ⅱ，進行蛋白質(zhì)沉淀,； 7. 過濾并離心,； 8. 如果需要沉淀*，將溶液冷卻至 -18 ℃,，然后迅速暖至室溫,，離心； 9. 用水稀釋上清液(稀釋比例1 / 4 , V/V),。
基于Tareke等人提出的方法[3]： 1. 稱量10 g勻漿的樣品,； 2. 加入100 mL水，和100 µL內(nèi)標(biāo) D3-丙稀酰胺 (10 µg/mL,，溶解于HPLC級的水中),； 3. 于12 mL Pyrex 玻璃離心管中進行離心； 4. 14000 r/min離心10 min,，上清液移入兩支Eppendorf管中,； 5. 用乙腈活化固相提取柱，然后用水清洗(2×2 mL) (多模式分離,，300 mg,，International Sorbent Technology 有限公司)； 6. 棄去開始的1 mL濾液,； 7. 其他的洗脫液,，用0.45 µm 濾膜進行過濾； 8. 用 500 µL超濾器 (Microcon YM-3, Millipore),，14000 r/min 離心10 min進行超濾,，接收200 µL濾液。
基于Jürgen Buhlert (CVUA Sigmaringen, 德國) 提出的方法（牛奶基質(zhì)）： 1. 用5倍的水稀釋樣品 (V/V),； 2. 加入內(nèi)標(biāo)D3-丙稀酰胺 ,； 3. 用Carrez試劑Ⅰ和Ⅱ進行蛋白質(zhì)沉淀； 4. 過濾； 5. 在LC-MS/MS進樣前,，每1 mL上清液中加入4 µL 甲酸,。
色譜分離條件 Agilent 1100 系統(tǒng)：G1312A二元泵系統(tǒng)、G1367A型自動進樣器,、柱溫箱,。 色譜柱[2]：1. Phenomenex Luna，3 µm,，C18,，150 mm×3 mm，基質(zhì)較簡單時推薦使用,； 2. Thermo Electron Hypercarb,，5 µm，100 mm×3 mm,，基質(zhì)較簡單時推薦使用 (例如可可飲料,，全麥面包等) 。 流動相：A相—水 + 0.1% 甲酸,；B相—甲醇 + 0.1%甲酸,。
MS/MS 檢測 API 3200™或3200 QTRAP® LC-MS/MS液質(zhì)分析系統(tǒng)。TurboIonSpray 離子源,、正離子方式,、MRM掃描 方式。
