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使用 Agilent凈化通過(guò)HPLC 測(cè)定防曬霜中的紫外線過(guò) 濾劑
閱讀：909 發(fā)布時(shí)間：2020-3-30化學(xué)防曬霜配方中含有紫外線 (UV) 過(guò)濾化合物,，可預(yù)防皮膚曬傷和 DNA 損傷。本 應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種對(duì)樣品進(jìn)行前處理,，然后對(duì)防曬產(chǎn)品中的活性 UV 過(guò)濾 劑成分進(jìn)行定量分析的可靠方法,。在進(jìn)行 HPLC 分析前,，采用有機(jī)萃取，然后通過(guò) 膜過(guò)濾,，從防曬乳液中提取活性成分,。雖然參比標(biāo)準(zhǔn)分析物的保留時(shí)間重現(xiàn)性佳 (%RSD ≤ 0.11)，但在色譜柱上連續(xù)進(jìn)樣防曬霜樣品時(shí),，觀察到嚴(yán)重的保留時(shí)間漂 移,、基線漂移和峰形不規(guī)則。使用 Agilent Captiva EMR-Lipid 色譜柱解決了色譜問(wèn) 題,，去除了提取樣品中的基質(zhì)脂質(zhì),。結(jié)果實(shí)現(xiàn)了可接受的定量準(zhǔn)確度和回收率水平 (95%–103.5%)，提高了連續(xù)進(jìn)樣 7 種非處方防曬產(chǎn)品中所有紫外線過(guò)濾劑保留時(shí)間 的一致性,。
化學(xué)防曬產(chǎn)品中的活性成分是 FDA 批準(zhǔn) 的芳香族化合物,，在紫外線范圍內(nèi)具有較 高摩爾吸收率。這些紫外線過(guò)濾化合物與 保濕劑,、乳化劑和增稠劑結(jié)合在一起,，可 制得穩(wěn)定配方，其中的活性成分可用于保 護(hù)皮膚免受紫外線輻射,。
需要進(jìn)行定量分析測(cè)試,，以確保非處方 (OTC) 防曬產(chǎn)品能提供廣譜保護(hù)且滿足美 國(guó)聯(lián)邦法規(guī)要求[1]。防曬霜配方復(fù)雜基質(zhì) 和活性成分的紫外線吸收率使 HPLC 成為 當(dāng)前方法,，以確保產(chǎn)品一致性和質(zhì) 量,。但是，這些產(chǎn)品中存在的基質(zhì)脂質(zhì)會(huì) 導(dǎo)致色譜重現(xiàn)性較差,，從而造成色譜柱污 染以及方法準(zhǔn)確度和精密度不可靠,。本應(yīng) 用簡(jiǎn)報(bào)討論了一種簡(jiǎn)單的樣品前處理技 術(shù)，可在使用 Captiva EMR-Lipid 色譜柱 分析防曬產(chǎn)品時(shí)提高色譜重現(xiàn)性并延長(zhǎng)色 譜柱壽命,。
試劑與標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC 級(jí)水,、HPLC 級(jí)異丙醇 (IPA) 和 5 種 FDA 批準(zhǔn)的紫外線過(guò)濾劑（通常用 于配制防曬霜[2]）的 USP 參比標(biāo)樣購(gòu)自 Sigma-Aldrich（表 1）?；旌厦糠N參比標(biāo) 樣 10 mg,，將其溶解在 IPA 中，使每種化 合物的終濃度達(dá)到 2 mg/mL,，制得標(biāo) 準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液,。該儲(chǔ)備液作為高校準(zhǔn)濃 度水平（5 級(jí)），還配制了四個(gè)連續(xù)稀釋的儲(chǔ)備液用作中間校準(zhǔn)濃度,，其中每種化 合物濃度為 1（4 級(jí)）,、0.5（3 級(jí)）,、0.25 （2 級(jí)）以及 0.125 mg/mL（1 級(jí)）,。
消耗品 以下消耗品用于樣品前處理： • 15 mL 離心管（Celltreat 部件號(hào) 229412） • Agilent 6 mL Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱 （部件號(hào) 5190-1004） • 10 mL NORM-JECT Luer Slip 進(jìn)樣針 （Henke Sass Wolf 部件號(hào) 4100-000V0） • 安捷倫接頭：1、3、6 mL（部件號(hào) 12131001） • 安捷倫優(yōu)級(jí) 0.2 µm 玻璃纖維/尼龍針 頭過(guò)濾器（部件號(hào) 5190-5132）• 安捷倫 2 mL 棕色螺口蓋樣品瓶（部 件號(hào) 5182-0716） • 安捷倫螺口蓋 PTFE/紅色硅膠隔墊 （部件號(hào) 5190-7024）
從個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中提取和凈化紫外線過(guò) 濾劑 用分析天平將 100 mg 防曬霜或潤(rùn)唇膏直 接稱入 15 mL 離心管中,。開(kāi)始提取時(shí),，將 2 mL 熱水（85 至 95 °C）加入試管中,， 將樣品劇烈振搖并渦旋混合 2 分鐘,。將 10 mL IPA 等分試樣加入試管中，再次渦 旋混合 2 分鐘,，然后超聲處理 10 分鐘,。 為促進(jìn)進(jìn)一步溶劑化和分散，將樣品以相 同方式再次進(jìn)行渦旋混合和超聲處理,。為促進(jìn)液相和固相的分離,，將樣品在 2500 rpm 下離心 15 分鐘。棄去沉淀塊并將一半左右的上清液小心轉(zhuǎn)移到 6 mL Agilent Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱中,。 將接頭塞蓋在過(guò)濾柱頂部,，并用 10 mL Luer Slip 進(jìn)樣針對(duì)樣品施加正壓。樣品混 合物以每滴 3–5 秒的流速低壓通過(guò)過(guò)濾 柱,。將洗脫液收集到潔凈的 15 mL 錐形 離心管中,。在前半部分流過(guò)后，將其余樣 品轉(zhuǎn)移到 EMR 過(guò)濾柱中,。采用安捷倫優(yōu) 級(jí) 0.2 µm 玻璃纖維/尼龍針頭過(guò)濾器過(guò)濾 樣品去除顆粒,，直接加入至 2 mL 棕色玻 璃樣品瓶中。
儀器配置：本分析使用由 Agilent ChemStation 軟件 （版本 C.01.09）控制并配備四元泵,、 真空脫氣機(jī),、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱熱 交換器和二極管陣列檢測(cè)器 (DAD) 的 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng),。使 用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱 (3.0 mm × 50 mm, 2.7 µm) 和 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 保護(hù) 柱 (2.1 mm × 5 mm, 2.7 µm) 進(jìn)行色譜分 離,。進(jìn)樣量為 1 µL，進(jìn)樣之間用 IPA 清 洗針頭 3 次,。用于分析物分離的等度流 動(dòng)相,、流速和柱溫箱為安捷倫專有。DAD 在 238 nm 波長(zhǎng)下用于數(shù)據(jù)采集,。分析停 止時(shí)間為 11 分鐘,。每次樣品分析后均運(yùn) 行不進(jìn)樣的空白，在該過(guò)程中,，用 95% IPA 沖洗色譜柱,，并在下一次進(jìn)樣前用流 動(dòng)相重新平衡。
結(jié)果與討論：標(biāo)準(zhǔn)品的系統(tǒng)適用性 該方法對(duì)參比混標(biāo)實(shí)現(xiàn)了出色的基線分離 度,，如圖 1 所示,。在 0.78 分鐘處觀察到 的負(fù)峰是進(jìn)樣的假陽(yáng)性結(jié)果。如先前的報(bào) 道,，在 1.92 分鐘處觀察到的峰是阿伏苯 宗標(biāo)準(zhǔn)品中的雜質(zhì)[3],。在 4.92 至 9.87 分 鐘之間觀察到的六個(gè)主要峰是按洗脫順序 鑒定的標(biāo)準(zhǔn)品分析物：保留時(shí)間,、峰寬（半峰高）,、峰對(duì)稱性,、 USP 拖尾因子和分離度值證實(shí)了參比混標(biāo) 中六種成分出色的基線分離度（表 2）。 圖 2 為混標(biāo)的六次重復(fù)進(jìn)樣色譜圖,。該方 法提供了出色的保留時(shí)間重現(xiàn)性,，所有六 個(gè)參比標(biāo)樣峰的 RSD% 介于 0.06–0.11， 峰面積 RSD < 0.41%,。
