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技術(shù)文章

應(yīng)用一種新的毛細(xì)管ICP-MS接口進(jìn)行富硒酵母中含硒蛋白的鑒定

閱讀:970          發(fā)布時間:2020-3-19

飲食是人體硒 (Se) 的主要來源,該必需元素的攝入主要取決于食品中的硒含量 和所消耗的食物量,。由于許多國家農(nóng)產(chǎn)品中硒的含量很低,,所以硒缺乏成為了一 個值得注意的問題。人們已經(jīng)開發(fā)了許多提高人體硒攝入的食品添加策略,;富硒 酵母就是人和動物添加劑常用的硒來源之一,。

 

評估硒是否充分不僅需要了解硒總含量,而且還要了解各種形態(tài)硒的含量,。但 到目前為止,,大部分研究都僅限于針對占總硒 12-20% 左右的水溶性酵母成分。 酵母的不溶性硒組分很多尚未被發(fā)現(xiàn),,表征這類主要組分的工作非常少,,其中 Chassaigne 和 Chéry [1] 曾研究過酵母蛋白的硒特異性激光消融 (LA-) ICP-MS 指紋譜,Tastet 等人 [2] 曾用實(shí)驗(yàn)室自制的 nanoHPLCICP-MS 接口對富硒多肽進(jìn)行了硒選擇性檢測,。在常規(guī)方法 中,,通過測定總硒代蛋氨酸含量(含硒蛋白含量)來評估 富硒酵母的質(zhì)量。

 

本研究提出了一個安捷倫ICP-MS等離子體質(zhì)譜輔助的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,,用于 鑒定富硒酵母中的含硒蛋白,。采用雙向凝膠電泳分離不溶 性含硒蛋白。使用 LA-ICP-MS 找出分離后的含硒蛋白斑 點(diǎn),,經(jīng)切割后,,用胰蛋白酶消化;所得多肽通過毛細(xì)管 HPLC-ICP-MS 進(jìn)行分析,,然后用電噴霧離子化 (ESI-) MS/MS 進(jìn)行表征,,鑒定出富硒酵母中主要的含硒蛋白——甘油 醛-3-磷酸酯脫氫酶-3。由于胰蛋白酶裂解產(chǎn)物量非常少,, 所以需要使用毛細(xì)管色譜,。

 

實(shí)驗(yàn)部分:

樣品 硒含量為 2.3 mg/g 的市售富硒酵母樣品。

樣品前處理 采用過去文獻(xiàn)[3]所述的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)提 取,、雙向凝膠電泳分離和目標(biāo)斑點(diǎn)的胰酶裂解,。

HPLC-ICP-MS 和 ESI-MS/MS 分析 使用配備毛細(xì)管泵(部件號 G1376A)和手動進(jìn)樣閥(100 nL 定量環(huán))的 Agilent 1100 LC。取 8 µL 胰酶裂解產(chǎn)物加入 到 Agilent Zorbax 300 SB-C18 35 x 0.5 mm 5 µm 多肽卡 套柱上,采用流速 20 µL/min 的等度洗脫,,流動相為 2% 乙 腈 (ACN) - 0.1% 甲酸 (FA),。使用流動相沖洗樣品 2 分鐘, 然后反沖到 Agilent Zorbax 300SB-C18 150 x 0.3 mm x 3.5 µm 分離柱上,。使用梯度洗脫分離多肽,,A:水 + 0.1% FA;B:ACN + 0.1% FA ,,流速 4 µL/min,。洗脫程序見表 1。

使用 20 ppb Y,、Li,、Tl、Ce 的 2% 硝酸溶液優(yōu)化等離子體 條件和檢測參數(shù),。使用高能量氦碰撞池模式排除對硒同位 素的多原子干擾,。使用各 250 ms 的駐留時間采集 77Se、 78Se,、80Se,。
ESI LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀采用正離子模式;加熱器 和毛細(xì)管溫度分別為 50 °C 和 280 °C,。采用碰撞誘導(dǎo)解 離 (CID) 在 MS SIM 模式下(15% 標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量)對 300–1100 m/z 質(zhì)量范圍進(jìn)行測量,;碰撞能量設(shè)置為 55% 時 HCD 池中產(chǎn)生子離子。

 

結(jié)果和討論
蛋白質(zhì)在凝膠上的分離結(jié)果如圖 1 所示,。選擇用于證明 ICP-MS 輔助蛋白質(zhì)組學(xué)方法可行性的斑點(diǎn)用圓圈標(biāo)出,。根 據(jù) LA-ICP-MS 測量結(jié)果,該蛋白斑點(diǎn)在膠上所有斑點(diǎn)中硒 含量高,。
對該目標(biāo)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行胰酶裂解后的分離色譜圖見圖 2,。毛 細(xì)管 HPLC-ICP-MS 檢測了 6 個峰(圖 2a),其中 5 個可 以用 ESI Orbitrap MS/MS 進(jìn)行鑒定,。ICP-MS 檢測對確定 硒肽的保留時間非常重要,,可幫助找到質(zhì)譜圖中較小的硒 形態(tài),如圖 2d 所示,。使用基線 20 點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)差的 3 倍計(jì)算檢 測限 (LOD),。將該值與 1 ppm SeMet 信號進(jìn)行比較。所得 到的硒同位素 80 的 LOD(30% ACN,,0.1% FA 條件下) 為 0.2 pg,。氨基酸縮寫列表見表 3。
鑒定出的硒肽序列見表 4,。使用 ICP-MS 檢測所得信號與 ESI Orbitrap MS 在已鑒定硒肽對應(yīng)的 m/z 值的選擇離子 模式(圖 2c)所得的保留時間*匹配,。通過所得數(shù)據(jù)鑒 定出了含硒的甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶-3(表 5),。證明由 于蛋白鏈中的硫-硒取代途徑而引入硒,存在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 殘基中,,后者在酵母樣品中*發(fā)現(xiàn),。

 

結(jié)論:本文建立了有效的安捷倫ICP-MS輔助蛋白質(zhì)組學(xué)方法,用于鑒 定市售富硒酵母樣品不溶性硒組分中的含硒蛋白,。采用雙 向凝膠電泳分離含硒蛋白,并用胰蛋白酶進(jìn)行裂解,。采用 LA-ICP-MS,、毛細(xì)管 HPLC-ICP-MS 和 ESI MS/MS 組合 方法對裂解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、分析和表征,。由于胰酶裂解產(chǎn) 物量非常少,,所以需要使用毛細(xì)管色譜。采用本方法鑒定 出了甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶-3,,這是富硒酵母中的主要含 硒蛋白,。證明由于蛋白鏈中的硫-硒取代途徑而引入硒,存 在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 殘基中,,后者在酵母樣品 中*發(fā)現(xiàn),。

 

 

 

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