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AB液質(zhì)聯(lián)用儀分析硝基呋喃代謝物的實(shí)驗(yàn)方法
閱讀：656 發(fā)布時(shí)間：2019-9-9硝基呋喃類抗生素藥物及其代謝物具有制畸胎副作用,，且能誘發(fā)癌癥，引起了人們的高度關(guān)注,。歐盟,、美國、中國等諸多國家和地區(qū)先后禁止在動物源性食品中使用,，檢測限為不得檢出,。硝基呋喃原藥 對光敏感，在動物體內(nèi)迅速被代謝,，故檢測在食品中的代謝物,。
化學(xué)試劑 硝基呋喃（nitrofuran）化合物名稱、分子式和CA號： 呋喃它酮 3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinon，其代謝物為AMOZ,，C8H15N3O3,，CAS: 43056-63-9 呋喃唑酮 3-Amino-2-oxazolidinone ，其代謝物為AOZ,，C3H6N2O2,，CAS: 80-65-9 呋喃西林 Semicarbazide，其代謝物為 SEM,，CH5N3O，CAS: 57-56-7 呋喃妥因 1-Amino-hydantoin ,，其代謝物為AHD,，C3H5N3O2，CAS: 2827-56-7 硝基呋喃化合物及代謝物的結(jié)構(gòu)：
A：將藥物代謝物從組織中提取出來,；B：藥物代謝物與2-硝基苯j(luò)ia醛(2-NBA,，C7H5NO3，CAS: 552-89-6) 的衍生化反應(yīng),。 建議的內(nèi)標(biāo)：D4-AOZ,，D5-AMOZ，13C15N2-SEM,，13C3-AHD,。
色譜分離流動相的制備 1 M乙酸銨溶液：77 g乙酸銨溶解于1 L HPLC級的水中。 流動相A：在1 L HPLC級的水中,，加入1 mL 1 M 乙酸銨溶液,。 流動相B：在1 L HPLC級的甲醇中，加入1 mL 1 M 乙酸銨溶液,。
樣品制備(肉,、蝦樣品) 基于 Leitner 等人提出的方法[1]： 1． 稱取1 g勻漿的組織樣品； 2．加入內(nèi)標(biāo),； 3．加入0.125 M鹽酸和2-硝基苯j(luò)ia醛(2-NBA),； 4．調(diào)節(jié)pH值為7.4； 5．離心,； 6．用乙酸乙酯在 Extrelut 柱上提取上清液,； 7．揮干溶劑； 8．用500 µL流動相[水+1 mM乙酸銨 / 甲醇＝90 / 10],。 回收率[2]：AOZ ～70%,；AMOZ ～80%；SEM ～70%,；AHD ～70%,。
樣品制備(肝臟組織) 基于Conneely等人提出的方法[3]： 1．稱量5 g浸水并勻漿過的肝臟組織，衍生化過夜； 2．將樣品溶液pH值調(diào)成中性,，用乙酸乙酯提取,，揮干溶劑； 3．將殘?jiān)苡? mL水中,，上樣到準(zhǔn)備好的MAX柱上,； 4．先用2%氨水溶液3 mL清洗，然后用3 mL甲醇進(jìn)行洗脫,，揮干溶劑,； 5．將殘?jiān)苡? mL水中，上樣到準(zhǔn)備好的HLB柱上,； 6．先用2%乙酸溶液(溶劑：水 + 甲醇＝1/1) 3 mL清洗,； 7．然后用3 mL溶于90%甲醇中的2%的氨水溶液進(jìn)行洗脫。
樣品制備(蜂蜜樣品) 基于Blake等人提出的方法[1]： 1．加50 µL內(nèi)標(biāo)溶液到5 g蜂蜜中,； 2．熱水中超聲5 min,，使混合均勻； 3．加入20 mL 0.3 M鹽酸(混合300 mL 1 M HCl和700 mL的水制成),，振搖使均勻,； 4．加入1 mL衍生化試劑(將1 g 2-NBA溶解于50 mL二甲亞砜DMSO中制成，用前新鮮配制),； 5．渦流混旋1 min,，使混合均勻，37 ℃保溫16 h進(jìn)行衍生化,； 6．加入2 mL 1 M磷酸緩沖液(磷酸緩沖液pH=7.4),，加入1 M NaOH(7.3～8.2 mL)到溶液pH=7±0.5，注 意：pH值不可以超過7.5,； 7．加入15 mL HPLC級的乙酸乙酯,，渦旋混合5 min； 8．在3000 r/min離心10 min,，直至有機(jī)相與水相明顯分層,，如果沒有很好分層，繼續(xù)離心,；分析硝基呋喃代謝物的實(shí)驗(yàn)方法9．仔細(xì)轉(zhuǎn)移上面乙酸乙酯層溶液5 mL,，到一干凈的16 mm×100 mm的玻璃試管中意不要將下面 水層溶液帶入； 10．蒸發(fā)到只剩1 mL左右,； 11．再仔細(xì)轉(zhuǎn)移出3 mL上層乙酸乙酯溶液,，到相同玻璃試管中； 12．蒸發(fā)到只剩1/2時(shí),，渦旋混合,，再蒸發(fā)至干； 13．加入200 µL甲醇進(jìn)行溶解，再加入200 µL水,，混合均勻,。然后取出200 µL到樣品瓶中，備用,。
色譜分離條件 Agilent 1100 系統(tǒng)：G1312A二元泵系統(tǒng),、G1367A型自動進(jìn)樣器、柱溫箱,。 色譜柱：Phenomenex LUNA,，3 µm，C18(2),，150 mm×2 mm,。 流動相：A相—水 + 1 mM 乙酸銨；B相—甲醇 + 1 mM 乙酸銨,。 梯度設(shè)置：
MS/MS檢測 AB API 3000™ LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀系統(tǒng)，TurboIonSpray® 離子源,，正離子模式,，MRM掃描方式
