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液相色譜系統(tǒng)分析初榨橄欖油中的生育酚和生育三烯酚
閱讀：1210 發(fā)布時間：2019-8-13本應(yīng)用簡報中展示了利用帶熒光檢測的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)對初榨橄欖油中的生育酚和生育三烯酚進行正相色譜分析,。結(jié)果顯示，與標準的不 銹鋼系統(tǒng)相比,，使用生物惰性系統(tǒng)可大大改善保留時間及峰面積的精度,。所有八種維 生素 E 異構(gòu)體均具有*的線性，且檢測限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 均在低 µg/mL 范圍 內(nèi),。九個橄欖油樣品的分析結(jié)果表明：橄欖油中 a-生育酚的含量為 100 至 390 mg/kg,。 且檢測發(fā)現(xiàn)，不*精制和初榨橄欖油中的維生素 E 含量相同,。
初榨橄欖油來自橄欖樹 (Olea europea L.) 的果實,，加工過程僅使用機械壓榨，不采 用任何熱或化學處理,。為確保初榨橄欖油 產(chǎn)品的真實性,，包括無摻假、錯貼標簽,、 描述錯誤或產(chǎn)地誤導(dǎo),，過去二十年里已建 立有大量用于評估植物油的方法1,。其中 對于熱處理橄欖油的分析，在之前的應(yīng)用 簡報中已有詳細介紹2,3,4 ,。
營養(yǎng)學優(yōu)勢方面，初榨橄欖油是許多生物 活性成分的來源,，這些成分對人體健 康有較高的化學保護作用,。除了高含量的 單不飽和及多不飽和脂肪酸之外，它還含 有價值*的抗氧化成分,，如植物甾醇,、 類胡蘿卜素、酚類和維生素 E5,6 ,。這些生 物活性成分的含量與基因,、栽培和環(huán)境因 素相關(guān)。“維生素 E”這個名稱包含四種生 育酚（a-,、b-,、g- 和 d-生育酚）和四種 生育三烯酚（a-、b-,、g- 和 d-三烯生育 酚）異構(gòu)體,。所有這八種形式均包含一個 色原烷醇環(huán)和一個異戊二烯基，生育三烯 酚中具有 3 個雙鍵,，見圖 1,。在初榨橄欖 油中，生育酚/生育三烯酚總含量的 95% 是 a-生育酚6 ,。
由于維生素 E 的生物活性具有多樣性,，且 與大多數(shù)單體生育酚和生育三烯酚在癌癥 或梗塞預(yù)防中的作用相關(guān)，因此有必要對 維生素 E 進行全面的譜圖分析6,。采用合 適的色譜技術(shù)對所有維生素 E 異構(gòu)體進行 分離,、鑒定和定量是對維生素 E 進行全面 譜圖分析的重要因素。反相 (RP) 和正相 (NP) 高壓液相色譜 (HPLC) 均可用于分析 生育酚和生育三烯酚,。本應(yīng)用簡報中采用 了正相超高壓液相色譜 (UHPLC),，此系統(tǒng) 可實現(xiàn)所有維生素 E 異構(gòu)體的良好分離6 。 維生素 E 異構(gòu)體的熒光性質(zhì)使其可通過靈 敏的熒光檢測技術(shù)進行檢測,。
已知生育酚非常敏感,，常會發(fā)生降解，產(chǎn) 物包括（例如）生育酚紅,、生育酚紫,、 對生育酚、醌和二聚反應(yīng)產(chǎn)物7,。特別是 在光致氧化作用下會發(fā)生降解過程,，同 時在 Fe3+ 或 Cu2+ 離子存在時的氧化作用 下也會發(fā)生降解7,。由于后者的原因，在 不銹鋼 HPLC/UHPLC 體系中進行的液相 色譜分析常會得出非常差的保留時間和峰 面積精度,。為比較保留時間 (RT) 和峰面 積的重現(xiàn)性,，本應(yīng)用簡報中同時采用不 銹鋼（Agilent 1260 Infinity 四元液相色 譜系統(tǒng)）和生物惰性系統(tǒng)（Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)）進行 分析。
實驗部分 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色 譜系統(tǒng),，包括以下模塊： • Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵 (G5611A) • Agilent 1260 Infinity 生物惰性自 動進樣器 (G5667A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1330B),， 用于樣品冷卻 • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)， 配置生物惰性溶劑熱交換器 • Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器 (G1321B),，配置生物惰性標準 FLD 流通池 Agilent 1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng),， 包括以下模塊： • Agilent 1260 Infinity 四元泵 (G1311B) • Agilent 1260 Infinity 自動進樣器 (G1367E) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1330B)， 用于樣品冷卻 • Agilent 1290 柱溫箱 (G1316C) • Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器 (G1321B),，配置標準 FLD 流通池要在 1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)（不 銹鋼和生物惰性）中執(zhí)行正相色譜分析,， 清洗和柱塞桿密封墊必須從反相（標配） 更換為正相部件： • 柱塞桿密封墊 - 正相（部件號 0905- 1420） • 清洗密封墊 (PE)（部件號 0905-1718）
樣品 生育酚和生育三烯酚混合溶液標準品（溶 于庚烷）購自 LGC 標準品公司（特丁頓， 英國）,。一系列橄欖油（初榨及不*精制 橄欖油）購自本地商店,。對于正相分析， 橄欖油樣品采用庚烷稀釋至 100 mg/mL 的 濃度,，然后注射入 UHPLC 系統(tǒng)進行分析,。溶劑 正庚烷及甲基叔丁基醚 (tBME)均為 LC級， 購自西格瑪奧德里奇公司（圣路易斯,，密 蘇里州,，美國）。 色譜柱 Agilent LiChrospher DIOL 色譜柱,， 4 × 250 mm,，5 µm（部件號 79925DI-584） 軟件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版， 適用于 LC 和 LC/MS 系統(tǒng),，修訂版 C.01. 04 [35]
結(jié)果與討論 圖 2 中展示了采用正相色譜法成功分離生 育酚和生育三烯酚標準品（來自 LGC 標 準品公司）中的所有維生素 E 異構(gòu)體的色 譜圖,。實驗同時測定了兩種系統(tǒng)（1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)及 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)）中保留時間 和峰面積的精度。圖 2 所示為生物惰性系 統(tǒng)中六次分析的疊加圖,，其中的保留時間 和峰面積均具有出色的相對標準偏差,。 表 2 總結(jié)了兩種系統(tǒng)中維生素 E 異構(gòu)體分 析的結(jié)果。在生物惰性系統(tǒng)中,，保留時間 精度和峰面積結(jié)果更為優(yōu)異,，這是由于存 在 Fe3+ 離子時異構(gòu)體會經(jīng)歷氧化過程7 。 對于保留時間精度,，生物惰性系統(tǒng)可表 現(xiàn)出高達十倍的性能提高,，例如 a-生育 酚在該系統(tǒng)下的保留時間精度值 RSD 低 于 0.07%，而在不銹鋼系統(tǒng)中的 RSD 為 0.68%。同時,，使用生物惰性系統(tǒng)時,，峰 面積的精度也可提高三至十倍（a-生育酚 為四倍）。
為測定線性,、LOD 及 LOQ,，使用正庚烷以 1所有的維生素 E 異構(gòu)體均具有*的線 性，相關(guān)系數(shù)均大于 0.9998,。LOD 及 LOQ 均在低 µg/mL 范圍內(nèi),，例如在橄欖油中， 少量的 b-生育酚及 b-生育三烯酚也可被 檢測出,。比例逐級稀釋生育酚和生育三烯酚 標準品溶液，見表 3,。實驗準備了八個不同濃度的系列標準品溶 液,，然后計算峰面積和對應(yīng)濃度之間的線 性關(guān)系。LOD 及 LOQ 分別定義為信噪比 3:1 及 10:1 時的濃度,。表 4 列出了所有維 生素 E 異構(gòu)體的線性,、LOD 及 LOQ 結(jié)果。
圖 3 中展示了初榨橄欖油中維生素 E 異構(gòu) 體的組成分析,。與文獻報道類似6,，初榨 橄欖油中總維生素 E 異構(gòu)體含量的 95% 為 a-生育酚。此外,，還可檢測到少量的 g-生 育酚,，b-生育酚及 b-生育三烯酚。 實驗共檢測了九種橄欖油樣品中的維生素 E 含量,，見表 5,。所測定維生素 E 異構(gòu)體： a-、b-,、g 生育酚及 b-生育三烯酚的含 量與文獻中描述的含量一致,，例如，a-生 育酚的含量約為每千克橄欖油中含 100 至 390 mg6,8 ,。不*精制（樣品 3）和初榨 橄欖油（樣品 1,，2 和 4 - 8）在維生素 E 含量方面沒有任何差異。
結(jié)論 存在 Fe3+ 或 Cu2+ 離子時,，生育酚會因氧 化作用而發(fā)生降解7,。因此，在分析生育 酚和生育三烯酚時,，若想獲得高精度的 保留時間和峰面積,，我們強烈建議使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)。此生物惰性系統(tǒng)可將保留時間的 精度提高多達十倍，此外,，生物惰性系統(tǒng) 還可改善約十倍的峰面積精度,。 將采用庚烷的正相色譜法與生物惰性系統(tǒng) 聯(lián)用，八種維生素 E 異構(gòu)體均可獲得* 的線性,，并且 LOD 及 LOQ 值均在低 µg/mL 范圍內(nèi),。所測九種橄欖油樣品中的生育 酚/生育三烯酚含量為 100 至 390 mg/kg 橄欖油（以 a-生育酚為例）。不*精制 和初榨橄欖油中維生素 E 的含量無差異,。