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電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)達(dá)肝素鈉中亞硝酸根-賽默飛離子色譜
閱讀：536 發(fā)布時(shí)間：2019-6-4低分子肝素（low-molecular-weight heparin,，LMWH）是近年發(fā)展起來(lái) 的新一代肝素類抗血栓藥物,，其抗血栓作用優(yōu)于肝素,，而抗凝血作用低于肝 素,，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高,、體內(nèi)半衰期長(zhǎng),、出血傾向小 等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床,。根據(jù)LMWH的來(lái)源,、生產(chǎn)工藝、末端結(jié)構(gòu) 的不同,，LMWH分為許多不同的種類,，如達(dá)肝素鈉、依諾肝素,、納肝素鈣,、 帕肝素鈉、汀肝素鈉等,。達(dá)肝素鈉（Dalteparin Sodium）是低分子肝素的一 種,，由亞硝酸降解肝素得到，重均分子量5600-6400,，峰位分子量6000,，硫 酸化程度為2.0-2.5/雙糖單位[1]。
達(dá)肝素鈉的生產(chǎn)過(guò)程中使用了亞硝酸,，而亞硝酸根是一種毒性物質(zhì),，在 人體特定的環(huán)境條件下，可以合成一種很強(qiáng)的化學(xué)致癌物——N-亞硝基化合 物,，能夠誘發(fā)幾乎所有內(nèi)臟器官的腫瘤,。因此，檢測(cè)達(dá)肝素鈉中殘留的亞硝 酸根含量,，對(duì)保證患者用藥安全具有重要意義,。目前歐洲藥典使用離子色譜安培檢測(cè)法測(cè)定達(dá)肝素鈉中亞硝酸根含量[2]，國(guó)內(nèi)低分子肝素標(biāo)準(zhǔn)中使用化學(xué) 方法對(duì)亞硝酸根進(jìn)行限度檢查,，無(wú)含量測(cè)定[3],。歐洲藥典的方法未對(duì)樣品進(jìn)行 前處理，達(dá)肝素鈉保留在色譜柱上，縮短柱壽命,，且重現(xiàn)性較差,。本文建立 了離子色譜法分離、電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)達(dá)肝素鈉中的亞硝酸根含量的方法,，靈 敏度高,，線性、回收率,、重現(xiàn)性好,，可以延長(zhǎng)色譜柱壽命。
測(cè)試條件
儀器：戴安ICS 3000離子色譜系統(tǒng)（EG淋洗液發(fā)生裝置）,； 分析柱：IonPac AS19,，250×4 mm； 保護(hù)柱：IonPac AG19,，50×4 mm,； 柱溫：30 ℃； 淋洗液：氫氧化鉀（KOH） 梯度淋洗,；5-40 mmol/L KOH,，0-35 min； 40-5 mmol/L,，35-35.1min,； 流速：1.00 mL/min； 定量環(huán)：100 µL 抑制器：AMMS 4 mm,，再生液為25mmol • L-1硫酸
檢測(cè)方式：抑制型電導(dǎo)
樣品前處理
精密稱取達(dá)肝素鈉0.4 g,，加水溶解并稀釋至10 mL。 精密量取1 mL至離心管中,，加無(wú)水乙醇9 mL,，搖勻， 10000 r • min-1離心20 min,。取上清液,，過(guò)0.22 µm濾膜， 續(xù)濾液進(jìn)樣,。
結(jié)果和討論
樣品前處理?xiàng)l件的選擇
由于達(dá)肝素鈉是多羥基的多糖類物質(zhì),，堿性條件下離 子化，在離子交換柱上有很強(qiáng)的保留,，即使使用強(qiáng)的洗脫 溶液如1 mol • L-1氯化鈉也很難將其洗脫,。達(dá)肝素鈉侵占色 譜柱中的位點(diǎn)，可造成色譜柱容量下降,，離子保留時(shí)間縮 短,。去除待測(cè)液中的達(dá)肝素鈉后進(jìn)樣,，可解決這一問(wèn)題。
去除達(dá)肝素鈉的方法主要有乙醇沉淀,、陽(yáng)離子表面活 性劑沉淀,、超濾、透析等,。陽(yáng)離子表面活性劑的引入,，會(huì) 降低色譜柱的柱效；超濾膜可能含有亞硝酸根殘留,，影響 測(cè)定結(jié)果,；透析需要的時(shí)間較長(zhǎng)。與以上三種方法相比,， 醇沉操作簡(jiǎn)單,、快捷,，重現(xiàn)性好,，且不易引入雜質(zhì)，因此 本方法選用醇沉法對(duì)樣品進(jìn)行前處理,。
色譜柱的選擇
樣品溶液含有的陰離子,，除達(dá)肝素鈉正常含有的硫 酸根、殘留的亞硝酸根外,，還含有氯離子,、磷酸根離子 及其他未知陰離子。分別使用IonPac AS11-HC,，IonPac AS15,，IonPac AS19，IonPac AS23等色譜柱進(jìn)行分離,。 在氯離子和亞硝酸根之間出現(xiàn)未知色譜峰,，保留時(shí)間與亞 硝酸根接近。降低淋洗液濃度,，可增加未知峰與亞硝酸根 的分離度,，但同時(shí)也造成分析時(shí)間延長(zhǎng)。比較以上不同色 譜柱的測(cè)定結(jié)果,，在保證未知峰與亞硝酸根分離度的前提 下,，IonPac AS19色譜柱的分析時(shí)間短，亞硝酸根出峰 時(shí)間可控制在10 min以內(nèi),。IonPac AS19色譜柱良好的分 離效果與其高容量有關(guān),。
抑制模式的選擇
使用電導(dǎo)檢測(cè)器時(shí)，淋洗液有很高的檢測(cè)信號(hào),。抑 制器可降低淋洗液的背景電導(dǎo),，增加被測(cè)離子的電導(dǎo) 值,，改善信噪比。常用的抑制模式有化學(xué)抑制,、電抑制 等,。測(cè)定陰離子時(shí)，化學(xué)抑制使用酸作為再生液,；電抑 制使用外接水或電導(dǎo)池后流出的廢液作為再生液,。本方 法的待測(cè)溶液中含有高濃度的乙醇，在電抑制模式下,， 乙醇有響應(yīng)且會(huì)干擾亞硝酸根的測(cè)定,，而化學(xué)抑制模式 下乙醇無(wú)響應(yīng)值。因此,，本法采用25 mmol • L-1硫酸作為 再生液,，選用膜抑制器化學(xué)抑制。
重現(xiàn)性,、線性和靈敏度
取樣品溶液分別進(jìn)樣6次,，保留時(shí)間RSD為0.1%，峰 面積RSD為0.5%. 線性范圍 取25～1000 µg • L-1亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn) 樣,，以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行回歸計(jì)算,，回歸方程為： A=0.000787C+0.001007, r=0.9997 取20μg • L-1的亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，測(cè)定其峰高 微0.060 µS,，按照3倍信噪比計(jì)算其檢測(cè)限為1 µg • L-1,，按 照10倍信噪比計(jì)算其定量限為3.3 µg • L-1。
實(shí)際樣品分析及加標(biāo)回收
精密稱取樣品適量,，精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量加入,， 分別制成加標(biāo)濃度為25，50,，100,，200 µg • L-1的溶液， 回收率分別為98.5%～107.9%（n=3）,，見(jiàn)表1,。
結(jié)論
綜上所述，本文建立的亞硝酸根的測(cè)定方法,，不僅 操作簡(jiǎn)單,，靈敏度高，更具有重現(xiàn)性高,，更好的保護(hù)色 譜柱等優(yōu)點(diǎn),。本方法不僅可用于低分子肝素的質(zhì)量控 制，其前處理方法和檢測(cè)方法也適用于其他多糖類藥物 中的陰離子測(cè)定,。