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在線固相萃取非抑制離子色譜法測定嬰兒配方奶粉中的左旋肉堿
閱讀：714 發(fā)布時間：2019-5-30左旋肉堿（L-Carnitine, β-羥基γ-*銨丁酸）又稱肉毒堿或維生素 BT，其化學式為C7H15O3N,，分子量為162.2,，是一種類氨基酸。L-肉堿作為 載體將長鏈脂肪酸從腺粒體膜外輸送到膜內,，促進脂肪酸的β-氧化,，從降低 血清膽固醇及甘油三脂的含量，提高機體耐受力及減少代謝毒性作用[i-iv],。對 嬰幼兒來說,，L-肉堿在維持嬰幼兒生命及許多促進發(fā)育的生理過程，如生酮 作用,、蛋白質代謝等方面均有一定的功能[v,vi],。我國及許多其它國家已規(guī)定在 嬰幼兒食品配方中添加適量的L-肉堿，以滿足其生理需要,，更好地促進嬰幼 兒健康成長[vii-x],。
左旋肉堿極性較強，缺少發(fā)色基團,，定量分析困難,。國內外對左旋肉堿 的測定主要有酶法[xi,xii]、電泳[xiii,xiv]、流動相注射串聯(lián)質譜法[xv],，液相色譜 法[xvi-xix]等,。酶法專屬性強，但前處理繁瑣,，液相色譜法中低波長檢測則 干擾較多,，衍生法靈敏度高，但前處理復雜,，所用衍生劑毒性強,。其它方法 有的靈敏度較低。有的設備較貴等原因較少使用,。
離子色譜法可測定在水溶液中能電離的物質,。在酸性溶液中，左旋肉堿 表現(xiàn)為陽離子特性,，帶正電荷,，可用陽離子交換色譜柱分離。但左旋肉堿的 兩性特征使其在抑制后呈電中性,，無法采用抑制型電導檢測,。同時，奶粉中 左旋肉堿添加量較低,，需要更低檢出限的測定方法,。為此，我們通過實驗,， 摸索出左旋肉堿的在線固相萃取非抑制型離子色譜測定的新方法,。該方法前 處理簡便、檢測快速,，用于奶粉樣品中左旋肉堿的檢測,，結果令人滿意
測試條件
儀器：賽默飛戴安ICS系列離子色譜系統(tǒng)帶雙六通閥及雙泵。 分析柱: IonPac CS17 + IonPac CG17,，4 mm 濃縮柱: IonPac TCC-UPL1 MSA：0-20 min,，3 mM；流速：1 mL/min 柱溫：30 ℃
檢測方式：抑制型電導檢測
進樣量：500 µL
樣品前處理
稱取奶粉樣品約1 g至50 mL比色皿中,，加入超純水 14 mL,，適當搖晃，使奶粉充分溶解后加入21 mL乙腈沉淀蛋白,，靜置10 min,，取上層清液，10000 r/min離心 10 min后,，稀釋5倍,，將稀釋液依次通過0.22 µm尼龍濾膜 和OnGuard II RP柱,、Na柱，棄去6 mL初始流出液后采集 2 mL樣品用于離子色譜測定,。 OnGuard II RP柱（規(guī)格2.5 cc），預先使用10 mL甲 醇和15 mL水活化,。 OnGuard II Na柱,，用10 mL水活化。
結果與討論
1. 前處理條件的選擇
奶粉配方比較復雜,，含有大量蛋白質,、糖和鹽。如 果奶粉中的蛋白質不經去除而直接進入色譜柱,，則可能 吸附在色譜柱上,，導致色譜柱柱效降低甚至失效。沉淀 蛋白質的常用方法有重金屬鹽沉淀法,、酸沉淀法,、有機 溶劑沉淀法等。人為引入金屬鹽會導致去除成本升高,， 去除不干凈可能導污染色譜柱而使色譜柱失效,。如果采 用酸沉淀法，會引入大量氫離子,，對左旋肉堿出峰產生 干擾,。因此，這兩種方法在本試驗中均不考慮,。采用加 入乙腈沉淀蛋白的方法,，沉淀蛋白效果較好，可得到 澄清的上層溶液,。通過在1 g奶粉中加入1 mL,、2 mL、 5 mL,、10 mL,、14 mL的高純水來溶解奶粉，發(fā)現(xiàn)如果加 入水的量過少,，則奶粉溶解不充分,，考慮到檢出限的限 制，我們用14 mL高純水來溶解1 g奶粉樣品,。用乙腈來沉 淀蛋白,，乙腈的量是需要考慮的重要因素。在14 mL的奶 粉樣品中加10 mL,、14 mL,、18 mL,、21 mL、24 mL的乙 腈,，發(fā)現(xiàn)如果乙腈的加入量小于水的量,，則蛋白沉淀不 *，大量蛋白懸浮于溶液中,，無法沉淀,。隨乙腈加入 量加大，沉淀蛋白速度加快,，上層液更加澄清,。考慮成 本因素,，終確定加入乙腈量為21 mL,。即可使蛋白沉淀 *，又不至于溶液中有太高比例的乙腈,，導致浪費和 后續(xù)處理困難,。 稀釋5倍的提取液依次通過RP柱和Na柱進行凈 化。用RP柱可除去疏水性的脂肪等物質,，Na柱作為陽離 子交換柱,，可除去鉀、鈣等陽離子,，避免可能的干擾,。
2. 閥切換條件的確定
進樣后，將閥切換到濃縮柱一邊,，用純水將樣品沖入 濃縮柱,，這時，殘留的陽離子及左旋肉堿濃縮在柱上,，乙 腈被沖出,。5分鐘后，乙腈被沖洗干凈,。再將閥切換到分離 柱側,，左旋肉堿在色譜柱上得到分離。比較了不同時間純 水的沖洗效果,，5分鐘比較合適,，可將乙腈及其它無保留雜 質沖洗干凈。閥切換配置圖如圖1所示,，切換程序見表1,。
3. 色譜柱的選擇 因為是非抑制電導檢測，所以為了降低噪音,，需要 選擇低淋洗強度淋洗液就能洗脫的離子交換柱,。在戴安 產品中符合要求的柱子有IonPac CS17,、 IonPac CS18 （6.0 µm, 250 mm×2 mm）、IonPac SCS1三種不同色 譜柱,。實驗發(fā)現(xiàn),，IonPac SCS1柱親水性差，左旋肉堿的 峰形不好,。IonPac CS17,、 IonPac CS18都是很低疏水性 的柱，左旋肉堿的峰形對稱性好,。但實際樣品測試的時 候，IonPac CS18柱上左旋肉堿被不明峰干擾,。因此,，選 擇CS17 + CG17作為分析L-左旋肉堿的色譜柱。
4. 淋洗液濃度的確定
依次選用6,、5,、4、3,、2 mmol/L的甲基磺酸,，測定 奶粉中左旋肉堿的色譜分析特征，確定合適的淋洗液濃 度,。結果表明：隨淋洗濃度從6 mmol/L降低到2 mmol/ L,，背景電導從2231 uS降低至777 uS，噪聲降低,，理 論塔板數提高,，各成分間的分離度增大，峰形改善,，信 噪比從12增大至67.8,，但保留時間也從6.91 min增大至 15.51 min。,。綜合考慮,，我們選擇3 mmol/L的甲基磺酸 作為分析用淋洗液。在優(yōu)化的淋洗液濃度下,，標準樣品 及真實樣品的左旋肉堿色譜圖如圖2所示,。
5. 干擾因素
通過在前處理時加入鈉柱，去除鎂,、鈣,、鉀、鐵,、 銅,、錳,、鋅等陽離子，避免干擾左旋肉堿,。干擾電導響 應的乙腈,，也已經在切換濃縮過程被純水沖出濃縮柱， 因此不會干擾左旋肉堿的檢測,。
6. 檢出限與線性范圍
按實驗方法在選定的色譜條件下,，對左旋肉堿進行 線性和檢出限測定。取標準工作液,，以高純水稀釋成 0.05,、0.1、0.2,、0.5,、0.8、1 mg/L,，用離子色譜進行 檢測,，以峰面積y對質量濃度x（mg/L）進行作圖，得回 歸方程y=0.686x-0.006,。線性范圍17.5 mg/Kg～175 mg/ Kg,，相關系數r>0.9995。取標準工作液,，以高純水稀釋 成0.01,、0.02、0.03,、0.04 mg/L,，按優(yōu)化條件進行處理 后，以信噪比（S/N）≥3的低濃度作為奶粉中左旋肉 堿的檢出限,，測得左旋肉堿檢出限為5 mg/Kg,。
7. 精密度與回收率
按實驗方法，取市售奶粉樣品進行不同濃度加標試 驗,，連續(xù)進樣5次,，測定左旋肉堿平均回收率和精密度， 結果列于表2,，該方法的回收率在92.3%～105.2%之間,， RSD在1.4%～4.3%之間。
實際樣品分析:
按實驗方法,，惠氏膳兒加產品包裝上左旋肉堿標示 含量為7.7 mg/100 g,、本文所測結果與之接近?；菔蠍蹆?樂和伊利奶粉包裝上未標識添加有左旋肉堿,，但本試驗 依然檢出,，這可能與天然奶源中就含有一定量左旋肉堿 有關。
結論
采用閥切換-非抑制型離子色譜法來測定奶制品中的 左旋肉堿,，具有簡單,、快速、干擾少,、環(huán)保等特點,。相 比常見的其它測試方法，避免了繁瑣的前處理,，無需衍 生化,，節(jié)約時間，重復性好,，檢出限能滿足要求,。該方 法可用于奶粉中左旋肉堿的含量測定。
但本方法也有不足,，即無法區(qū)分左旋肉堿和右旋肉 堿，這是作者仍需繼續(xù)研究的課題之一,。
