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SCX-C18混合填料色譜柱分析奶粉中三聚氰胺
閱讀：1425 發(fā)布時(shí)間：2019-3-26三聚氰胺（Melamine）含氮量為66.6％,，折合成粗蛋白含量為416.27%，加入寵物飼料和牛奶中可以大幅提高蛋白質(zhì)測(cè)定表觀含量,，但食用后可誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡,，因此一直禁止在飼料和食品中使用。2007年,，國(guó)內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子,，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月,，國(guó)內(nèi)發(fā)生奶粉中三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件,。
目前對(duì)于三聚氰胺的檢測(cè)，常規(guī)的方法為L(zhǎng)C方法,。但由于該化合物含有三個(gè)有機(jī)氮基團(tuán),，極性強(qiáng)，在普通C18反相柱上難以保留,，無法達(dá)到分離效果,。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的HPLC方法基本都須加入離子對(duì)試劑以增加三聚氰胺的保留，但辛烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑恰恰限制了LC-MS的應(yīng)用,。本文采用新型的SCX-C18混合填料色譜柱測(cè)定三聚氰胺,，該柱內(nèi)填充的是均勻混合的SCX和普通C18填料顆粒，兼具離子交換和反相分離的特點(diǎn),，檢測(cè)中不需加入離子對(duì)試劑,，還可應(yīng)用與LCsolution聯(lián)機(jī)，操作簡(jiǎn)便,，靈敏度高,。
儀器概況
本實(shí)驗(yàn)使用島津Prominence LC-20A液相色譜儀系統(tǒng)。LC-20A是島津制作所投入整體力量開發(fā)的新一代液相色譜儀,，具有以下特點(diǎn)：*的基本性能,，輕松滿足客戶對(duì)儀器嚴(yán)格的要求；全自動(dòng)化操作,，實(shí)現(xiàn)了分析的率,；高度對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)要求的綜合管理系統(tǒng),，改善分析工作環(huán)境。
本次實(shí)驗(yàn)所用儀器的具體配置為L(zhǎng)C-20AD輸液泵,，DGU-20A3在線脫氣,，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱,，SPD-20A紫外可見檢測(cè)器,，CBM-20A控制器和LCsolution色譜工作站。
分析方法
色譜柱：CAPcell Pak CR(1:4) 4.6×150mm 5μm
檢測(cè)波長(zhǎng)：243nm
流動(dòng)相：15mM醋酸銨緩沖液(pH3.0):乙腈=7:3
流速：1.2mL/min
柱溫：30℃
進(jìn)樣量：10μL
洗脫方式：等度洗脫,。
樣品前處理方法
取奶粉樣品0.5g,，準(zhǔn)確加入5mL三氯YI酸溶液和0.2mL乙酸鉛溶液，搖勻,，超聲提取20min,。轉(zhuǎn)入離心管，在10000r/min離心機(jī)上離心5min,，取上清液, 0.45μm濾膜過濾,，上機(jī)測(cè)定。
分析結(jié)果
1.保留時(shí)間與峰形
圖1為本方法檢測(cè)三聚氰胺標(biāo)樣的典型色譜圖（樣品濃度為5ug/mL）
圖1 三聚氰胺標(biāo)樣圖譜
由圖1可見,，本方法所測(cè)三聚氰胺保留時(shí)間為9.38min,，峰形尖銳，對(duì)稱性好,。
2.精密度
取濃度為5μg/mL三聚氰胺標(biāo)樣,，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示,。
| 編號(hào) | 保留時(shí)間(min) | 峰面積(μV.S) |
| 1 | 9.378 | 113178 |
| 2 | 9.388 | 112902 |
| 3 | 9.397 | 112677 |
| 4 | 9.397 | 112874 |
| 5 | 9.409 | 112909 |
| Average | 9.394 | 112908 |
| %RSD | 0.12 | 0.16 |
表1 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性
由表1結(jié)果可見,，本方法測(cè)定三聚氰胺具有良好的精密度和重現(xiàn)性。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線
取標(biāo)準(zhǔn)品,，用緩沖液稀釋成濃度為0.5μg/mL,、1.0μg/mL、5.0μg/mL,、50μg/mL,、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣,，得到校準(zhǔn)曲線(見圖2),。
圖2 校準(zhǔn)曲線
結(jié)果表明，該方法線性良好,，相關(guān)系數(shù)為0.9999,。
4.加標(biāo)回收率
取奶粉空白樣品，加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，使奶粉中終含量分別為0.5mg/kg,、5mg/kg和50mg/kg,，結(jié)果如下：
圖3 空白奶粉
圖4 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺
圖5 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺
圖6 空白奶粉添加50mg/kg三聚氰胺
加樣回收率結(jié)果如表2所示。
| 加樣量(mg/kg) | 計(jì)算結(jié)果(mg/kg) | 回收率 % | 平均回收率% |
| 0.5 | 0.55 | 109.3 | 115 |
| 0.60 | 120 | ||
| 5.0 | 4.56 | 91.2 | 92.9 |
| 4.72 | 94.5 | ||
| 50 | 48.6 | 97.2 | 97.8 |
| 49.2 | 98.4 |
表2 3個(gè)不同濃度樣品回收率
5.檢測(cè)限和定量限
用軟件計(jì)算出奶粉中三聚氰胺含量檢測(cè)限為0.43mg/kg ,，定量限為1.31mg/kg,。
6.實(shí)際樣品分析結(jié)果
按本方法測(cè)定某品牌的奶粉，得到的圖譜如圖7所示,。兩份重復(fù)樣品中測(cè)得三聚氰胺的濃度分別為19.7和19.8mg/kg,，重現(xiàn)性良好。(用反相離子對(duì)色譜法測(cè)得的兩次結(jié)果分別為19.1和19.2 mg/kg)
圖7 某品牌陽性樣品檢測(cè)結(jié)果
結(jié)論
本方法定量限為1.31mg/kg,，具有操作簡(jiǎn)單方便,，靈敏度較高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。流動(dòng)相中不用加入離子對(duì)試劑,，為L(zhǎng)CMS的分析提供了可能,。且樣品經(jīng)提取后可不用經(jīng)過SPE步驟即可進(jìn)樣,，大大簡(jiǎn)化了分析過程,，節(jié)省了分析成本。本方法適合奶粉中三聚氰胺含量的測(cè)定,，特別是大批量樣品的低成本快速檢測(cè),。