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采用GC Orbitrap質(zhì)譜儀對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行定量分析的常規(guī)方法
閱讀：1508 發(fā)布時(shí)間：2019-2-25【概述】
食品貿(mào)易的長(zhǎng)足發(fā)展使各種果蔬得以全年供應(yīng)。不過(guò)，這也對(duì)努力確保食品供應(yīng)鏈安全的食品安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)提出了全新的挑戰(zhàn),，特別是各地可能使用的數(shù)百種農(nóng)藥的安全問(wèn)題,。為此，歐盟制定了為嚴(yán)格的農(nóng)殘法規(guī)：2008年,，歐盟頒布EC No. 396/20051法規(guī),，將尚未設(shè)置實(shí)質(zhì)性大殘留*（MRL）的所有農(nóng)藥/商品組合的默認(rèn)MRL設(shè)置為10μg/Kg；繼此,，2009年,，農(nóng)藥安全審查EU 91/414/EEC2指令使約250種農(nóng)藥得以批準(zhǔn)，并將所有其他農(nóng)藥的容許殘留量設(shè)置為默認(rèn)限值（10μg/Kg）,；近,，新版“食品飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法確認(rèn)的指導(dǎo)文件SANTE/11945/2015”于2016年年初正式實(shí)施3。該指導(dǎo)文件介紹了方法驗(yàn)證和分析質(zhì)量控制（AQC）的要求,，以支持在農(nóng)殘*控制框架內(nèi)報(bào)告并用于大殘留*（MRLs）合規(guī)性檢查,、執(zhí)法行動(dòng)或消費(fèi)者暴露評(píng)估的數(shù)據(jù)的有效性。該文件預(yù)期供歐洲*控制實(shí)驗(yàn)室使用,，而實(shí)際上被廣泛用于世界各地的農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室,。嚴(yán)格的要求的實(shí)施為致力于提供具有成本競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的服務(wù)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提出了巨大挑戰(zhàn)。
農(nóng)殘測(cè)試通常要求使用結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜儀的液相和氣相色譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),。這些分析技術(shù)必須符合選擇性監(jiān)測(cè)的化合物范圍和靈敏度的要求,，但是于檢測(cè)那些在數(shù)據(jù)采集時(shí)進(jìn)行測(cè)量的目標(biāo)農(nóng)藥，故需謹(jǐn)慎的方法優(yōu)化和管理,，以確保所選離子監(jiān)測(cè)窗口可行,。近年來(lái)，高分辨率Orbitrap質(zhì)譜儀憑借其附加逐步添加逐步成為MS/MS技術(shù)的替代技術(shù),。
使用高分辨率質(zhì)譜儀（HRMS）時(shí),，默認(rèn)采集模式為非靶向（全掃描）模式，便于管理和在單次進(jìn)樣中監(jiān)測(cè)無(wú)限數(shù)量的農(nóng)藥,。此外,，全掃描數(shù)據(jù)分析還提供對(duì)定性識(shí)別點(diǎn)的補(bǔ)充（如質(zhì)譜圖檢索）的訪問(wèn)，使樣品的回顧性分析成為可能,，以另行檢索在數(shù)據(jù)采集時(shí)未予考慮的新興農(nóng)藥或其他雜質(zhì),。
在本研究中，按照 SANTE/11945/2015指導(dǎo)文件,，在全掃描模式下,，針對(duì)果蔬中 GC 可測(cè)農(nóng)藥的常規(guī)分析，對(duì)Thermo ScientificTM Exactive GC OrbitrapTM質(zhì)譜儀的定量特性進(jìn)行了評(píng)估,。Exactive GC-MS系統(tǒng)提供高達(dá) 60,000 （m/z 200 時(shí) FWHM） 的常規(guī)高質(zhì)量分辨率和適合 GC 峰的掃描速度,，促進(jìn)復(fù)雜基質(zhì)成分中痕量化合物的檢測(cè),。
【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】
表1. GC條件。
表2.質(zhì)譜儀條件
【實(shí)驗(yàn)/操作方法】
從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)入西紅柿,、韭蔥和橙子,，按照檸檬酸鹽緩沖體系的QuEChERS方法進(jìn)行前處理，將10 mL乙腈加入10 g均質(zhì)樣品中,，振蕩4分鐘,。加入鹽混合物，將離心管振蕩4分鐘,，再以3700 rpm的速度離心5分鐘,。將上清液（5 mL）轉(zhuǎn)移到內(nèi)含硫酸鎂和125 mg PSA的15 mL PTFE離心管中。在渦旋振蕩器中振蕩提取物,，如上進(jìn)行離心,。終的乙腈提取物（1g/mL）用作空白基質(zhì)。制備校準(zhǔn)液系列時(shí),，取100μl乙腈空白基質(zhì)在氮?dú)饬飨赂稍?。在含有適當(dāng)濃度農(nóng)藥的100μl乙酸乙酯中對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)溶。
在西紅柿,、韭蔥和橙子體系中，配制51種農(nóng)藥的三個(gè)校準(zhǔn)液系列,，濃度為0.5,、1、2,、5,、10、20,、50,、100、200
和500μg/Kg,。這51種農(nóng)藥涵蓋了范圍廣泛的化學(xué)農(nóng)藥類別,，使用這三種基質(zhì)共產(chǎn)生153種農(nóng)藥/基質(zhì)組合。評(píng)估化合物線性時(shí),，先分析與校準(zhǔn)液系列匹配的基質(zhì),，再對(duì)每種基質(zhì)的10μg/Kg樣品進(jìn)行10次重復(fù)進(jìn)樣。評(píng)估一段時(shí)間內(nèi)的可重復(fù)性,，再將同一樣品瓶中10μg/Kg的西紅柿標(biāo)樣進(jìn)樣100次,。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】
本研究旨在根據(jù)SANTE指令要求評(píng)估Exactive GC系統(tǒng)在三種不同樣品基質(zhì)中對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行常規(guī)分析的性能。所選樣品
（西紅柿,、韭蔥和橙子）呈現(xiàn)了常規(guī)測(cè)試中常見(jiàn)的簡(jiǎn)單和復(fù)雜基質(zhì),。為加以說(shuō)明,，圖1顯示了不同樣品復(fù)雜度的總離子色譜圖（帶固定Y軸）。韭蔥基質(zhì)顯然是復(fù)雜的基質(zhì),，需以高質(zhì)量分辨率將目標(biāo)分析物從化學(xué)噪聲背景中提取出來(lái),。
針對(duì)常規(guī)農(nóng)藥篩查，HRMS處理軟件需快速,、準(zhǔn)確且可根據(jù)不同的需求進(jìn)行定制,。TraceFinder可滿足所有這些要求，并在5分鐘內(nèi)處理各批校準(zhǔn)標(biāo)樣和10次復(fù)制樣品,。在TraceFinder中,，結(jié)果以表格格式呈現(xiàn)給用戶，并使用數(shù)據(jù)標(biāo)記來(lái)快速識(shí)別陽(yáng)性農(nóng)藥和所滿足的標(biāo)準(zhǔn),。靈活的報(bào)告選項(xiàng)意味著數(shù)據(jù)可導(dǎo)出到其他軟件或直接從TraceFinder進(jìn)行結(jié)果的報(bào)告,。
根據(jù)指導(dǎo)要求進(jìn)行確認(rèn)
該分析的一個(gè)目的是確定全部三種基質(zhì)中所有農(nóng)藥的檢出限（LOD）、確認(rèn)限（LOI）,、線性范圍和峰面積重復(fù)性,。盡管SANTE指導(dǎo)文件中并未討論LOD，但由于依據(jù)定量離子得到的的檢測(cè)限用于形成終的校準(zhǔn)系列,，并終用于確定樣品中檢測(cè)到農(nóng)藥的濃度,，因此掌握定量離子的檢出限十分有益。通過(guò)評(píng)估基質(zhì)匹配校準(zhǔn)系列和每種基質(zhì)10μg/Kg水平的農(nóng)藥的重復(fù)進(jìn)樣評(píng)估LOD,。LOD定義為農(nóng)藥主要定量離子的提取離子色譜圖（XIC）中存在S/N（峰到峰）＞3的峰,。LOI的確定應(yīng)遵SANTE/11945/2015指導(dǎo)文件。為進(jìn)行正確確認(rèn),，應(yīng)滿足以下要求：
圖1. Y軸固定于4.0 e9的西紅柿,、韭蔥和橙子提取物的全掃描總離子色譜圖（TIC），顯示本研究中所用樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,。
(i)每種農(nóng)藥檢出兩種離子且質(zhì)量度< 5 ppm,，峰S/N > 3
(ii)保留時(shí)間容差±0.1 min（與同一序列的標(biāo)準(zhǔn)品相比）
(iii)離子比率在同一序列標(biāo)準(zhǔn)品的平均離子比率的±30%以內(nèi)。
(iv)可選項(xiàng)：為使鑒定達(dá)到更高的置信度,，可使用其它標(biāo)準(zhǔn),，如全掃描質(zhì)譜、同位素模式匹配及其他碎片離子,。
遵循監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)（LOI）對(duì)所有濃度小于等于5μg/Kg（表3-5）的基質(zhì)中除韭蔥中百菌清以外的所有農(nóng)藥進(jìn)行鑒定,。百菌清因與韭蔥基質(zhì)中的硫化合物相互作用而發(fā)生損失。5153種農(nóng)藥/基質(zhì)組合（79%）中的多數(shù)具有≤ 2μg/Kg的確認(rèn)限,。圖2為計(jì)算出的檢出限匯總,，圖中顯示93%的農(nóng)藥/基質(zhì)組合的檢出限≤ 1μg/Kg。多個(gè)鑒定點(diǎn)和遠(yuǎn)低于MRL的檢出限增加了鑒定的置信度并降低了假陰性和假陽(yáng)性的結(jié)果,。將電子轟擊電離（EI）與全掃描采集相結(jié)合能夠用多定性
離子鑒定農(nóng)藥,。
圖2.農(nóng)藥/基質(zhì)組合的檢出限（LOD）和確認(rèn)限（LOI）
Exactive GC系統(tǒng)生成標(biāo)準(zhǔn)的EI質(zhì)譜圖,，重現(xiàn)性高，易于庫(kù)檢索（低分辨或高分辨率MS數(shù)據(jù)庫(kù)）,，讓基于質(zhì)譜圖檢索進(jìn)行的農(nóng)藥檢測(cè)和鑒定更加方便,。由于Orbitrap分析儀的質(zhì)量度足夠高，化學(xué)式可輕松的與碎片離子質(zhì)量數(shù)吻合,，故可快速添加此結(jié)果至化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中,。
定量可靠
在0.5-500μg/Kg的濃度范圍內(nèi)，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量線性評(píng)估,。在所有情況下,，在三種基質(zhì)中，從檢出限到500μg/Kg,，每種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)（R2）均> 0.99,。圖3為TraceFinder瀏覽器顯示的撲滅津?qū)嵗,；蚴芊治鑫镂降挠绊?，苯銹啶的濃度線性至200μg/Kg，屬于個(gè)別例外,。定量取決于多項(xiàng)因素,，其中一項(xiàng)因素為采集速度，采集速度應(yīng)足夠快速,，以能在色譜峰中提供至少12個(gè)點(diǎn),。Exactive GC系統(tǒng)的分辨率達(dá)60,000，掃描速度約7 Hz,。圖4為在6秒峰上有38個(gè)點(diǎn)的乙酯殺螨醇峰。
圖3.顯示鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性的農(nóng)藥,、提取離子色譜圖及校準(zhǔn)圖的TraceFinder瀏覽器（以撲滅津?yàn)槔?。在校?zhǔn)范圍內(nèi)和10μg/kg重復(fù)樣品樣中sub-ppm的撲滅津的質(zhì)量度。當(dāng)超出規(guī)定時(shí)提示并標(biāo)記鑒定標(biāo)準(zhǔn)信息,。
表3.韭蔥中農(nóng)藥的方法性能總結(jié),。*韭蔥中降解的百菌清。
圖4.在分辨率為60,000（m/z 200時(shí)FWHM）的條件下,，從添加濃度為10μg/Kg的韭蔥樣品中獲得的乙酯殺螨醇（m/z 251.0025±5 ppm質(zhì)量窗口）的提取離子色譜圖,。結(jié)果顯示~38次掃描/峰（峰寬6s）。每次掃描所達(dá)到的度低于1 ppm（每第三次掃描標(biāo)記一次）,。峰上的平均RMS質(zhì)量差異為0.6 PPM,。
圖5顯示在所有三種基質(zhì)中重復(fù)進(jìn)樣10次（濃度為10μg/Kg）的結(jié)果。所檢測(cè)到的農(nóng)藥的%RSD小于10%,，遠(yuǎn)低于SANTE指導(dǎo)文件所規(guī)定閾值（20%）,，表明在分辨率為60k條件下以全掃描模式所運(yùn)行的Exactive GC系統(tǒng)達(dá)到了可靠分析農(nóng)藥所需的選擇性和靈敏度,，遠(yuǎn)低于各自的MRL。
圖5.所研究的三種基質(zhì)中,，每種農(nóng)藥在濃度為10μg/Kg（n=10）條件下的峰面積重復(fù)性（%RSD）,。圖中還顯示SANTE指導(dǎo)文件的閾值為20%。
表4.橙子中農(nóng)藥的方法性能結(jié)果總結(jié),。* LOD-200μg/Kg
可靠的質(zhì)量度
當(dāng)檢測(cè)復(fù)雜樣品基質(zhì)中的低濃度農(nóng)藥時(shí),，獲取可靠的質(zhì)量數(shù)測(cè)定至關(guān)重要。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中,，較低的質(zhì)量誤差可在使用窄質(zhì)量提取窗時(shí)確保高選擇性并有助于確保陽(yáng)性檢測(cè)的可靠性,。通過(guò)辨別基質(zhì)干擾和目標(biāo)分析物離子的高質(zhì)量分辨力，使用Exactive GC系統(tǒng)時(shí)可達(dá)到低質(zhì)量誤差,。當(dāng)分辨率不足時(shí),，兩個(gè)離子質(zhì)譜圖重疊，造成目標(biāo)化合物的讀出質(zhì)量數(shù)產(chǎn)生偏離,。圖6為在分辨率分別為15K,、30K、60K條件下,，對(duì)濃度為10μg/Kg的韭蔥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品所做的分析,。
質(zhì)譜圖顯示二甲嘧菌胺的定量離子和產(chǎn)生干擾的質(zhì)量相近的基質(zhì)離子。在 15 K 和 30 K 條件下,，未能分離二甲嘧菌胺離子,，致使質(zhì)量度較差，分別為 10.1 ppm和 6.3 ppm,。但在 60 K 條件下,，離子被*分類，達(dá)到預(yù)期質(zhì)量度（小于1 ppm）,。如達(dá)不到此質(zhì)量分辨率,，則此農(nóng)藥將達(dá)不到 SANTE 鑒定標(biāo)準(zhǔn)（＜ 5 ppm）且會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果（報(bào)告為“未檢測(cè)到”）。這支持了先前的報(bào)告,，即在某些情況下,，為確保高選擇性，分辨率需達(dá)到 60 K（200 m/z）,。6
圖6.在15K,、30K和60K的分辨率條件下，分辨率對(duì)添加濃度為10μg/Kg的韭蔥樣品中二甲嘧菌胺診斷離子質(zhì)量度的影響,。在15K和30K條件下,，二甲嘧菌胺離子未從干擾基質(zhì)離子中分離出來(lái)，致使質(zhì)量度分配較差,。
表5.西紅柿中農(nóng)藥的方法性能結(jié)果總結(jié),。
對(duì)51種農(nóng)藥的LOI處進(jìn)行質(zhì)量度評(píng)估,，評(píng)估結(jié)果如圖7所示。所有分析物的質(zhì)量誤差值均未超過(guò)1.2 ppm,，遠(yuǎn)低于指導(dǎo)文件的限值（5 ppm）,，在的選擇性檢測(cè)中，提供高置信度,。
在農(nóng)藥分析中,，儀器應(yīng)能夠在整個(gè)可能遇到的分析物濃度范圍內(nèi)保持質(zhì)量度，這點(diǎn)也非常重要,。如因檢測(cè)器飽和而造成高濃度農(nóng)藥超標(biāo),，則無(wú)法接受。在Exactive GC系統(tǒng)中,，通過(guò)使用自動(dòng)增益控制（AGC）來(lái)控制離子的進(jìn)入數(shù)量,，從而保護(hù)Orbitrap分析儀免于飽和。這確保了無(wú)論濃度高低,，均能保持良好的質(zhì)量度,。如圖8所示，當(dāng)韭蔥基質(zhì)中的濃度范圍為0.5～500μg/Kg時(shí),，四種農(nóng)藥的質(zhì)量度始終< 1 ppm,。
圖7.三種基質(zhì)中每種農(nóng)藥在LOI處的質(zhì)量差異測(cè)定值
圖8.韭蔥中四種農(nóng)藥在0.5-500μg/mL的濃度范圍內(nèi)的質(zhì)量度測(cè)定值。質(zhì)量度保持在
1 ppm以下,。
實(shí)際性能
在高通量常規(guī)農(nóng)藥分析實(shí)驗(yàn)室,，質(zhì)譜儀始終處于持續(xù)運(yùn)行的狀態(tài)，因此儀器在相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持同等性能水平非常重要,。為評(píng)估Exactive GC系統(tǒng)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的性能,，在同一樣品瓶中對(duì)濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物重復(fù)進(jìn)樣100次。開(kāi)始分析前,，安裝一個(gè)新的進(jìn)樣口襯管,，調(diào)諧離子源并校準(zhǔn)MS。
在66小時(shí)的連續(xù)運(yùn)行中未進(jìn)行其他干預(yù),。結(jié)果表明，從進(jìn)樣器到MS,，該系統(tǒng)性能持續(xù)穩(wěn)定,。圖9顯示經(jīng)過(guò)100次進(jìn)樣，濃度為10μg/Kg的西紅柿中的六氯苯,、乙烯菌核利和氟樂(lè)靈的峰面積響應(yīng),，其中RSD%分別為5.3%、4.6%和3.8%,。此外,，在未做進(jìn)一步質(zhì)量校準(zhǔn)的情況下,，分析持續(xù)時(shí)間內(nèi)的質(zhì)量度穩(wěn)定性< 1.2 ppm（99% ≤1 ppm）（圖10）。
圖9.添加濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物的100次重復(fù)進(jìn)樣,。結(jié)果表明,，在66小時(shí)的連續(xù)運(yùn)行中均保持良好的靈敏度。
圖10.濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物中六氯苯,、乙烯菌核利和氟樂(lè)靈100次進(jìn)樣的質(zhì)量度(ppm),。在使用同一襯管且不進(jìn)一步校正質(zhì)譜儀或調(diào)諧離子源時(shí)獲得的數(shù)據(jù)。
結(jié)論
本研究結(jié)果表明,，與TraceFinder軟件配用的Thermo ScientificExactive GC Orbitrap高分辨率質(zhì)譜儀是一個(gè)高性能的分析系統(tǒng),，可在*遵循SANTE指導(dǎo)文件的前提下，針對(duì)果蔬中的常規(guī)農(nóng)藥分析,，提供穩(wěn)定的,、高靈敏度的分析定量性能。
—經(jīng)檢測(cè),，99.3%的農(nóng)藥/基質(zhì)組合可在低于MRL下檢測(cè)到,，線性良好且符合所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)。重要的是,，在全掃描采集模式下,，使用化合物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理增加了分析物的范圍。
—當(dāng)在復(fù)雜樣品基質(zhì)中篩選農(nóng)藥時(shí),，以60,000 FWHM的分辨率進(jìn)行采集顯著降低了基質(zhì)干擾并提高了結(jié)果的置信度,。針對(duì)較寬濃度范圍內(nèi)的所有化合物均達(dá)到sub-ppm的一致質(zhì)量度，確保了化合物在不同濃度水平下檢測(cè)的置信度,。
—西紅柿基質(zhì)以10μg/Kg的濃度重復(fù)進(jìn)樣表明系統(tǒng)能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持性能一致性,，符合常規(guī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的要求。
【儀器/耗材清單】
儀器
ExactiveTMGCOrbitrapTM質(zhì)譜儀
Thermo ScientificTMTriPlusTMRSHTM自動(dòng)進(jìn)樣器
Thermo ScientificTMTRACETM1310氣相色譜儀