G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素

基本信息CAS號  108321-42-2

分子式  C20H40N4O10·2 H2SO4

分子量  692.7 g/mol

外觀  白色粉末

純度  ~98%

活力溶解性  >700 μg/mg 溶于水

產(chǎn)品簡介

       G418 Sulfate（G418硫酸鹽）,，也稱作Geneticin（遺傳霉素），是一種結(jié)構(gòu)類似于慶大mei素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素,，G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素通過影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來干擾蛋白合成,，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌,、酵母,、高等植物和哺乳動物細(xì)胞，也包括原生動物和蠕蟲,。其抗性基因（主要為neo基因）位于轉(zhuǎn)座子Tn601（903）或Tn5（來源于細(xì)菌）,，但是可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。通過基因重組技術(shù)將這些抗性基因?qū)爰?xì)胞,，使其獲得對G418的耐藥性,，從而用來篩選和維持培養(yǎng)攜帶抗性基因的原核或者真核細(xì)胞。 哺乳動物細(xì)胞中，當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后，使其編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase,，APH(3')II）,。此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用,，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性,。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn),，需要建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）確定殺死無抗性細(xì)胞的zui低有效濃度。 植物細(xì)胞中,，通過轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性,。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個酶使得多種抗生素喪失活性,，包括G418,，卡那mei素和巴龍mei素。

使用說明

1. G418儲存液的配制（50 mg/mL,，活性濃度）

   （1）活力單位的換算

根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A₀）×A₁=A₂,，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異,?？梢娕螌?yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽,。A₁是想配制的活性G418濃度,。A₂是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為：750 µg/mg,，要配制50 mg/mL的G418活性濃度,，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418儲存液（活性濃度,，50 mg/mL）,，則需要稱取663.3 mg粉末。

（2）除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量,，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其wan全溶解,。

先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水,。之后使用此濾器過濾,，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定,。

【注】

     ①不要對混濁的溶液進(jìn)行過濾,，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨磜an全溶解,，過濾過程中會造成藥物損失，降低終液的活性,。

     ②不建議使用液體培養(yǎng)基,，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲存液,。

2. 常用篩選濃度

一般來說,，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個較低濃度的G418用于維持培養(yǎng),。生長條件,，細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過殺滅曲線（kill curve）,，即劑量反應(yīng)性曲線,，來確定最佳篩選濃度。

通常情況,，哺乳動物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL,；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL,。

以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度,，可做參考。

3. 殺滅曲線的建立

 【注意事項(xiàng)】為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度，可通過建立殺滅曲線來實(shí)現(xiàn),，至少選擇6個濃度,。處理分裂期的細(xì)胞時G418的活性zui強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時間,。

（1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,，37℃，CO₂培養(yǎng)過夜,。

     【注】對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞,，可增加接種量。

（2）根據(jù)細(xì)胞類型,，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度,。以哺乳動物細(xì)胞為例，可設(shè)定0,，50,，100，200,，400,，800，1000 μg/mL。

（3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基,，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基,。每個濃度做三個平行孔。

（4）接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基,。

（5）按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度,。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

      （1）轉(zhuǎn)染48 h后,，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）,。

    【注】細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果好。當(dāng)細(xì)胞過于稠密,，其效率會降低,。為了得到較好的篩選效果，請最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%,。

（2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液,。

（3）篩選7天后觀察并評估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況,。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染以及篩選效果,。

（4）挑取并轉(zhuǎn)移5-10個抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板,，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

（5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可,。

運(yùn)輸與保存方法

常溫運(yùn)輸,。-20℃避光保存，有效期3年,。避免受潮,，否則會降低抗生素活力。

注意事項(xiàng)

（1）本品不可高壓滅菌,；

（2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青mei素/鏈mei素）共同使用,，因?yàn)樗鼈兪荊418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會產(chǎn)生交叉活性,。

（3）配制G418溶液時,，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液及工作液,。

（4）G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會被殺死,，原因在于藥物濃度過低，或者細(xì)胞密度過高,。另外,，快速分裂的細(xì)胞相對于緩慢增殖細(xì)胞,，更容易被殺死。對照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成,。

（5）即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會繼續(xù)分裂2-3次,。G418的藥效通常在2天后才變得明顯,。

（6）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。