實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性*,，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性的定量方法,，已得到全世界的*，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域,。定量PCR除可以對樣品的初始濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量外,，還有其它多種豐富的應(yīng)用。還包括基因表達(dá)調(diào)控情況的分析,、等位基因的分析等,。

探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

熒光定量PCR服務(wù)：
簡介：實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,，而且與常規(guī)PCR相比,，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題,、自動化程度高等特點(diǎn),，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異,；驗(yàn)證基因芯片,，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成,，主要定量PCR儀器。
1,、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料,；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）,。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列,。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2,、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成,。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn),，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料,。
3,、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。
以下產(chǎn)品是公司正在*產(chǎn)品：
 

L-(+)-二苯酰酒石酸一水物人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

N,N-二基甘氨酸鹽酸鹽人子宮頸上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

N,N-二基甘氨酸鹽酸鹽人支持細(xì)胞*培養(yǎng)基

二酮肟二鈉鹽八水合物人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

二酮肟二鈉鹽八水合物人腎管狀上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

1,3-二苯脲人腎皮層上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

1,3-二苯脲人腎上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

二硫代草酰氨人輸尿管上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

二硫代草酰氨人腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞*培養(yǎng)基

沒食子酸月桂酯人腎系膜細(xì)胞*培養(yǎng)基靈芝酸KFura-2五鈉鹽

(+)-香樹脂酚鈣熒光探針I(yè)ndo-1, AM  

安納基林鈣熒光探針I(yè)ndo-1, AM  

葉下珠新素鈣熒光探針I(yè)ndo-1, AM （1 mM DMSO溶液）

新夏佛托苷Indo-1五鉀鹽

牡荊素-4''-O-葡萄糖苷Indo-1五鈉鹽

苦瓜素 I鈣熒光探針Quin-2, AM

箭藿苷C鈣熒光探針Quin-2

5-沒食子?；鼘幩徕}熒光探針Rhod-2, AM

表兒茶素3-O-(3''-O-基)沒食子酸酯鈣熒光探針Rhod-2, AM 

熒光化學(xué)物質(zhì)：
馬疥螨探針法熒光定量PCR試劑盒實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán),。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時,，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）,，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺,。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料,，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步,。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線,，確定PCR反應(yīng)是否特異,。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對,，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后,，退火過程中,，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 ,。